Бактериологический метод: назначение, цель, этапы. Методы выделения аэробов.

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 3Следующая ⇒

Бактериологический (культуральный) метод — комплекс методов для выявления патогенных микроорганизмов у больного, у носителя или на объектах внешней среды. Это метод выделения, выращивания и определения свойств чистой культуры микроорганизмов с целью установления принадлежности к той или иной систематической группе (виду, роду) и называется их идентификация. Выделение чистой культуры основа бактериологического метода.

Чистая культура — микроорганизмы одного вида, полученные из одной или нескольких клеток в результате размножения на искусственной питательной среде.

Бактериологическое исследование может быть использовано для диагностики, профилактики инфекционных заболеваний, для санитарно-гигиенической характеристики среды, окружающей человека, для научного исследования.
Материал и метод бактериологического исследования зависят от цели анализа, условий среды, патогенеза и течения заболевания.

В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование. Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:

1-й день (I этап). - Основная цель этого дня – произвести посев исследуемого материала таким способом и методом, чтобы получить рост изолированных колоний.

1. Макроскопическая оценка исследуемого материала (объём, цвет, характер, консистенция). От этой оценки зависит подготовка материала к посеву и выбор сред.

Механический метод выделения чистой культуры используют если:

Материала много и он жидкий (моча, СМЖ), то материал центрифугируют и для посева используют осадок, предварительно слив надосадочную жидкость, таким образом, посевной материал содержит все микроорганизмы исследуемого материала.

Если материал вязкий ( гной, мокрота, фекалии), то небольшую порцию материала растирают со стерильным физ. раствором и полученную эмульсию используют для посева.

Если материал плотный (кусочки ткани или кости), то с них делают смыв стерильным физ. раствором и засевают на среды смывы.

Физический метод используют, если исследуемый материал по направлению предполагает наличие споровых культур, в таком случае часть или весь материал прогревают до + 80⁰С, при этом сопутствующая вегетативная флора погибает, а сохранившиеся споры после посева прорастают и дают чистую культуру возбудителя.

Химический метод используют, если материал может предполагать наличие кислотоустойчивых бактерий, то в этом случае порцию материала обрабатывают 2-4 % раствором H₂SO_4,а затем нейтрализуют щёлочью под контролем индикатора и используют для посева. При такой обработке погибает вся сопутствующая флора, сохраняются только кислотоустойчивые бактерии. Соответственно поступают и при наличии щёлоче- и спиртоустойчивых бактерий.

Биологический метод. К этому методу относят добавление в питательную среду антибиотика, к которому устойчив предполагаемый возбудитель, этом случае гибнет под воздействием данного антибиотика вся сопутствующая флора в исследуемом материале. Также к биологическому методу относят заражение исследуемым материалом лабораторных животных, чувствительных к данному возбудителю, после чего у животного берут материал и высевают на питательные среды.

Метод элективных сред позволяет выделить определённого возбудителя, за счет нахождения в питательной среде элективного фактора к которому чувствительна сопутствующая флора.

2. В некоторых случаях проводят микроскопию мазка из исследуемого материала, окрашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой и ориентировочного ответа, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева.

3. Если в исследуемом материале заведомо мало выделяемого возбудителя, то такой материал засевают на среды обогащения, в этом случае бактериологическое исследование длиться дольше на один или несколько дней.

4.Затем посев материала на питательные среды для получения изолированных колоний. Среды подбирают также исходя из особенностей предполагаемого возбудителя и характера материала.

Способ посева может быть открытым или закрытым, что зависит от возможности предполагаемого возбудителя находиться в воздухе.

Для того чтобы получить рост изолированных колоний можно использовать методы посева, выполненные с помощью бак. петли, шпателя, стеклянной палочки и ватного тампона :

Шпатели и бак.петля.

А.Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют оставшуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на третьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наименьшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изолированные колонии.

Метод Дригальского.

Б.Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на одной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора - метод посева по секторам. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, делая посевную площадку, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из первого сектора во второй и таким же образом последовательно в третий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после суточного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.

Посев по секторам с посевной площадкой.

Посев по секторам можно произвести и без посевной площадки. Начав с первого сектора без прокаливания петли произвести посев последовательно во втором, третьем и четвёртом секторах.

Посев по секторам.

В. Можно использовать и другие техники посева. Например, посев бактериологической петлёй штрихами или зигзагообразно по всей поверхности чашки Петри. Для этого исследуемый материал набирают стерильной петлей и втирают в поверхность среды возле края чашки.

После этого петлю стерилизуют в пламени, чтобы уничтожить избыток материала, охлаждают. Следующий этап посева начинают с места, где закончился предыдущий. Петлю кладут горизонтально на поверхность агара, где было сделана посевная площадка, проводят один-два раза по поверхности и делают штрихи по остальной среде. Необходимо пытаться, чтобы штрихи посева длились от края к краю чашки, не повреждали поверхности агара и располагались близко друг к другу. Этим искусственно продлевается линия посева и создаются возможности для получения изолированных колоний.

Посев шпателем и тампоном в чашки Петри. Материал предварительно наносят на поверхность питательной среды возле края чашки петлей или пипеткой. Стерильный шпатель проносят через пламя, охлаждают, касаясь стенки чашки. Осторожными круговыми движениями распределяют материал равномерно по поверхности среды.

5.Засеянные чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат для инкубации на 24 часа при 37⁰С.

2-й день (II этап). Начинают данный этап с изучения культуральных свойств полученных колоний. На основании изучения этих характеристик, выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отбирают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью изучения морфологических и тинкториальных свойств и проверки однородности микробов в колонии (приготовление мазка, окраска по Граму). Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным питательным агаром с целью накопления чистой культуры. Пробирку инкубируют в термостате 24 часа при температуре 37° С.

Посев на скошенный агар.

Техника посева в пробирки со скошенной средой: На скошенные среды переносят культуру из другой пробирки или с колоний на чашках. Прокалённой петлёй берут часть необходимой колонии с чашки Петри, чашку закрывают и отставляют. Пробирку держат в левой руке наклонном положении между большим и указательным пальцами так, чтобы поверхность среды можно было наблюдать. Петля - в правой руке. Пробку пробирки вынимают, зажимая их между мизинцем и ладонью. В таком положении она остаётся до конца посева. Край пробирки обжигают, переносят петлю, не прикасаясь к стенкам, в пробирку и делают сплошной штриховой посев. Петлю прокаливают, ставят в штатив, край пробирки прокаливают и закрывают пробкой. Техника посева в конденсационную воду: выбирают свежескошенную среду, содержащую на дне каплю конденсационной жидкости. Исследуемую культуру забирают петлей, открывают пробку, обжигают края пробирки, осторожно, не касаясь среды и стенок, вносят в конденсационную воду петлю с культурой. У выраженных подвижных культур рост с конденсационной воды распространяется на влажную поверхность косяка.

Й день (III этап).

1.Описывают культуральные свойства накопленной чистой культуры.

2.Проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка ( мазок окрашивают по Граму, в мазке должны быть однородные по морфологическим признакам и тинкториальным свойствам клетки). При однородности исследуемых бактерий выделение чистой культуры можно считать законченным.

3. Идентификация выделенной культуры проводится по:

- биохимическим свойствам.

Среды Гисса дифференциально-диагностические питательные среды для выявления ферментативной активности бактерий. Содержат 1% пептонную воду, 0,5% раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, манит, сахароза и др.) и индикатор Андреде (кислый фуксин в растворе NaOH). Среда при рН 7,2-7,4 – бесцветна, при ферментации углеводов приобретает красный цвет. В пробирки со средой помещают поплавок (небольшая трубочка, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при расщеплении углеводов.

Пёстрый ряд Гисса для E.coli.

- чувсвительности к антибиотикам.

- антигенным свойствам

- фагочувствительности

Фаготипирование по методу Фишера. Испытуемую культуру засевают на МПА, затем условно делят чашку на квадраты. В каждый квадрат наносят по одной капле различных фагов. После суточной инкубации в термостате отмечают квадраты, в которых отмечается лизис бактерий. Фаготип бактериальной культуры определяется типом лизирующего ее фага.

Чувствительность к фагуустанавливают по наличию лизиса культуры (стерильных пятен)

Фагоидентификация по методу Отто. На чашку с МПА шпателем или петлёй выполняется посев выделенной культуры бактерий. Затем наносят каплю известного бактериофага и, наклонив чашку, дают капле несколько растечься по поверхности питательной среды. Через сутки наблюдают полную задержку роста в месте внесения диагностического фага.

- токсигенности и другим признакам.

4. Посевы инкубируют в термостате 24 часа при температуре 37° С.

4-й день (I V этап). Учет результатов и выдача ответа

Дата добавления: 2021-06-02; просмотров: 725; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 123 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!