Применение фиксирующих растворов.
ОТБОР И ДОСТАВКА МАТЕРИАЛА В ЛАБОРАТОРИЮ
Основные правила взятия и направления материала в микробиологическую лабораторию.
Результаты микробиологических исследований во многом зависят от правильного выбора, соблюдения всех правил отбора материала и направления его в лабораторию. Выбор материала определяется клинической картиной заболевания, предполагаемой локализацией возбудителя в организме на данном этапе и путей его выделения в окружающую среду.
1. Материал берут в ранние сроки заболевания, до начала антимикробной терапии в достаточном количестве.
2. Следует исключить попадание в материал антибиотиков, антисептиков, дезинфектантов.
3. При заборе, хранении и направлении материала в лабораторию строго соблюдаются правила техники бактериологической безопасности.
4. Материал собирают, соблюдая правила асептики для предупреждения его возможной контаминации нормальной микрофлорой организма больного и микроорганизмами окружающей среды. Используют стерильные инструменты и стерильную посуду, закрывающуюся ватно-марлевыми пробками. После взятия материала его в максимально короткие сроки направляют в лабораторию. При отсутствии такой возможности материал, за исключением ликвора, сохраняют непродолжительное время в холодильнике при 4°С.
5. Материал транспортируют в специальных биксах, пеналах или металлических контейнерах, которые после использования подвергают дезинфекции.
|
|
|
6. В микробиологической лаборатории все остатки патологического материала подлежат уничтожению (путем автоклавирования или сжигания).
Все материалы, направляемые в лабораторию, должны иметь сопроводительный документ - направление на специальном бланке, где указаны фамилия, имя, отчество больного, возраст, вид материала, дата взятия, предполагаемый клинический диагноз и другие сведения.
Окраска препаратов.
Для приготовления окрашенных препаратов из исследуемого объекта готовят мазки и фиксируют их. Приготовление окрашенного препарата состоит из нескольких последовательных операций: подготовка мазка, высушивание, фиксация, окраска.
Отбор материала.
Тампоны, содержащие микроорганизмы , прокатывают по предметному стеклу. С помощью тампонов готовят мазки из непрозрачных жидкостей (взвесь испражнений).
Мазки из материалов со слизистой , мазка из гноя или мокроты готовят растиранием их между двумя предметными стеклами.
Приготовление мазка: с помощью бактериологической петли кусочек субстрата помещают на середину предметного стекла, вторым стеклом покрывают сверху. Прижав одно стекло к другому, растирают материал, пока не получат тонкий мазок.
|
|
|
Прозрачные жидкости (мочу, спинномозговую жидкость) можно нанести в виде капли на предметное стекло, при этом границы капли обводят маркером.
Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок. При таком распределении материала в мазке при микроскопии можно увидеть изолированные бактериальные клетки. Если исследуемый материал содержится в жидком виде, то его непосредственно наносят петлей на предметное стекло и готовят мазок.
Препарат крови больного готовят так: предметным стеклом, отступив 1-2 см от края, следует прикоснуться к капле крови, выступившей после укола. Быстро, чтобы кровь не свернулась, ребром шлифованного стекла распределить её по всей поверхности.
Если препарат готовят из бактериальной культуры , выращенной на плотной питательной среде, то на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильного физиологического раствора. взятый материал осторожно круговыми движениями распределяют по стеклу ровным тонким слоем, после чего петлю стерелизуют в пламени горелки.
|
|
|
Высушивание мазков.
Мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре или в потоке теплого воздуха, держа предметное стекло высоко над пламенем горелки.
Фиксация.
Термическая фиксация ( над пламенем горелки) :
Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур.
Применение фиксирующих растворов.
Для более детального изучения структуры клеток применяют фиксирующие растворы, предотвращающие ферментативный аутолиз бактерий и стабилизирующие макромолекулы путем химического их сшивания.
Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей и в некоторых случаях мазки из культур микроорганизмов фиксируют погружением на 15-20 мин. в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова (смесь равных объемов этилового спирта и эфира), сулемовый спирт и другие фиксирующие жидкости (формалин, ацетон, пары осмиевой кислоты), глутаральдегид.
Методы окраски мазков.
|
|
|
Способность микроорганизмов окрашиваться разными красителями называется тинкториальными свойствами. Для окрашивания мазков используют анилиновые красители :
красные – фуксин , Конго красный;
синие – метиленовый синий, толуидиновый синий;
фиолетовый – генциановый, метиловый;
коричнево-желтый – везувин, хризоидин;
зеленые – бриллиантовый, малахитовый.
Все красители выпускают в виде порошков. Из них готовят насыщенные спиртовые и феноловые растворы. Для работы используют водно-спиртовые или водно-феноловые растворы красителей.
Методы окраски делят на ориентировочные ( простые) и дифференциальные (сложные).
При простых методах окраски мазок окрашивают каким-либо одним красителем. Красители, которые используют:
кислые красители – эритрозин, кислый фуксин, эозин;
основные красители – генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин.
Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время.
Окраску основным фуксином ведут в течение 2 минут, метиленовым синим в течение 5-7 минут, затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струйки воды не станут бесцветными. Затем окрашенный мазок высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе.
Препарат помещают на подставку для окраски исследуемым материалом вверх. Пипеткой наносят на него раствор красителя. По истечении указанного времени краситель осторожно сливают, препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.
На окрашенный и высушенный препарат наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Сложные методы окраски применяют для изучения структуры и химических особенностей бактериальной клетки.
Последовательно наносят на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоты и др. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.
Окрас методом Грама является сложным методом.
В 1884 году датский ученый Христиан Грам предложил способ окраски, позволяющий разделить бактерии на две группы. В одну группу входили бактерии, цитоплазма которых после окраски комплексом генцианового фиолетового с йодом не обесцвечивалась этанолом, в другую группу входили бактерии, у которых этанол обесцвечивал окрашенную цитоплазму. В дальнейшем по имени ученого бактерии стали называть, соответственно, грамположительными и грамотрицательными.
Окраска по Граму является важным диагностическим признаком. У грамположительных бактерий клеточная стенка удерживает краситель при обработке этанолом благодаря значительной толщине муреина, основного компонента клеточной стенки (до 40 слоев). У грамотрицательных бактерий клеточная стенка тонкая. 1-2 слоя муреина, входящие в ее состав, не могут удержать краситель внутри клетки после обработки этанолом. Бактерии легко обесцвечиваются. Для того, чтобы увидеть грамотрицательные бактерии в микроскоп, их дополнительно окрашивают фуксином или сафранином. В результате грамотрицательные бактерии приобретают красную окраску и их легко отличить от грамположительных прокариот, окрашенных в синий цвет.
Окрас по методу Грама.
· На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин ее снять, а краситель слить.
· Нанести раствор Люголя на 1-2 мин.
· Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
· Промыть водой.
Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.
Грамположительные бактерии окрашиваютсяв темно-фиолетовыйцвет, грамотрицательные - в красный.
Окраска бактериальных спор.
Некоторые роды грамположительных бактерий, такие как Bacillus, Clostridium, способны в неблагоприятных условиях образовывать внутриклеточные эндоспоры. В отличие от вегетативной клетки они обладают меньшим количеством свободной воды, а также высоким содержанием липидов и кальция. Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за малой проницаемости оболочки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспринимается только вегетативной частью микробной клетки, а спора остается бесцветной. Проницаемость её оболочки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при использовании концентрированного раствора краски с подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработке кислотой не обесцвечивается , в то время как вегетативные клетки немедленно отдают краску.
Для выявления эндоспор используют старые культуры. Различают три типа спорообразования: бациллярное, клостридиальное и плектридиальное. Если при образовании споры в центре клетки форма ее не меняется, то такой тип спорообразования называется бациллярным. Если клетка в середине утолщается и приобретает вид веретена, то такой тип спорообразования называется клостридиальным. Иногда спора образуется ближе к концу клетки и тогда клетка приобретает вид теннисной ракетки. Такой тип спорообразования называется плектридиальным. Расположение споры в клетке может быть центральным, терминальным и латеральным. Свободные споры могут иметь круглую, овальную или продолговатую форму. Каждый отдельный вид спорообразующих бактерий образует только один тип споры, имеющей только одно определенное расположение. Иными словами, спорообразо-вание, тип споры и ее расположение являются таксономическими признаками бактерий, по которым можно определить их вид.
Дата добавления: 2021-04-15; просмотров: 92; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!