Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови при помощи AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit.
1) Добавить 500 мкл буфера Ap-1 в 1,5 мкл эпиндорф;
2) Добавить 200-250 мкл антикоагулированной цельной крови (аналогично моча) и перемешать на вортексе 10 секун;
3) Добавить 100 мкл буфера Ар-2 и перемешать на вортексе 10 секнуд;
4) Центрифугировать 10 минут при 12000хg;
5) Добавить супернатант из предыдущего пункта в колонку, вложенную в 2 мкл бюкс и центрифугировать 1 минуту при 12000хg;
6) Убрать жидкость из бюкса, поставить колонку обратно в бюкс и добавить туда 700 мкл буфера WIA. Инкубировать 2 минуты при комнатной температуре и центрифугировать 1 минуту при 12000xg;
7) Убрать жидкость из бюкса, поставить колонку обратно в бюкс и добавить туда 800 мкл буфера W2. Центрифугировать 1 минуту при 12000xg;
8) Убрать жидкость из бюкса, поставить колонку обратно в бюкс и добавить туда 500 мкл буфера W2. Центрифугировать 1 минуту при 12000 xg (для лучшей очистки);
9) Убрать жидкость из бюкса, поставить колонку обратно в бюкс. Центрифугировать 1 минуту при 12000xg;
10) Поместить колонку в 1,5 мкл пробирку и добавить 80-200 мкл ТЕ буфера (он должен быть предварительно разогрет до 65°С). Инкубировать 1 минуту, центрифугировать 1 минуту при 12000хg.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - осуществляемая in vitro специфическая амплификация нуклеиновых кислот, инициируемая синтетеческими олигонуклеотидными праймерами. ПЦР состоит из тепловой денатурации геномной ДНК, ее отжига с праймерами и удлинения цепи (элонгации); смена этих этапов происходит в результате изменения температуры реакционной смеси. В ходе ПЦР происходит экспоненциальное увеличение количества копий амплифицируемой последовательности. Благодаря этому последовательности, присутствующие в клиническом препарате в минимальном количестве (одна или несколько копий) и не поддающиеся обнаружению никакими другими методами, легко выявляются с помощью ПЦР. Экспоненциальное увеличение числа копий молекулы-мишени не только связано с высокой чувствительностью метода, но и облегчает их выявление, а дизайн праймеров, комплементарных только амплифицируемому участку генома, обеспечивает специфичность реакции. Каждый раунд ПЦР занимает от 2 до 5 минут, и обычно для достижения необходимой чувствительности достаточно 25-35 раундов, т.е. 1,5-2 часа. Таким образом, весь анализ можно провести в течение одного дня.
|
|
|
1) Денатурация - в эту стадию происходит разлделение матричной ДНК на отдельные цепи. Температура денатурации устанавливается в пределах 94°-96° С и зависит от содержания GC связей (наиболее прочных);
2) Связывание (отжиг) праймеров – в эту стадию происходит спецефическое связывание (отжиг) праймера с комплементарной ему частью матричной ДНК. Температура отжига определяется по специальной формуле T(отжига)=2∙(t+a)+4∙(g+c), где t,a,g,c – количество соответствующих нуклеотидов в праймере. Эта формула имеет ограничения – может использоваться только при длинах праймеров до 15 п.н. При большей длине праймеров пользуются более точной формулой, представленной ниже :
|
|
|
T(отж)= 64,9°С +41°С(g+c - 16,4)\N , где N – длина праймера(п.н.) ;
3) Элонгация (удлинение) праймеров при синтезе ДНК – в эту стадию происходит удлинение праймеров на матричной последовательности в соответствии с принципом комплементарности исходной и синтезируемой цепей с участием фермента термостабильной Taq-полимеразы. Оптимальная температура - 72° С. Время этого этапа обычно определяется по длине ДНК, которое необходимо получить. Было определено, что полимераза при 72° С может удлинить фрагмент длиной в 1 т.п.н. за одну минуту. Итого, для фрагментов длиной 100-500 п.н. обычно ставится время элонгации в 30 секунд.
Основные этапы ПЦР изображены на рис. 1.
Рис.1. Принцип полимеразной цепной реакции. Двухцепочечную ДНК-матрицу денатурируют (разделяют на отдельные цепи) и проводят отжиг с двумя праймерами. Праймеры присоединяются к противоположным цепям навстречу друг другу, определяя границы целевого амплифицируемого фрагмента. В процессе достройки праймеров происходит копирование участка ДНК, расположенного между двумя праймерами, и в результате количество матрицы удваивается. Цикл реакций денатурации матрицы, отжига и удлинения праймеров повторяется 25-35 раз. При избытке праймеров и других компонентов реакции после 25 циклов теоретически может получиться более 8 млн копий фрагмента
|
|
|
В ходе анализа к 1,0 мкл геномной ДНК добавляли 0,3 мкл каждого праймера, 1,5 мкл эквимолярной смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP), 1ед Taq-полимеразы, 5 мкл 5-ти кратного (или 2,5 мкл 10-ти кратного) буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 2.5 мМ MgCl2 (таблица 1). Помещали образцы в многоканальный программируемый термоциклер (амплификатор) CFX Real-Time PCR Systems (Bio-Rad). Инкубация происходила при заданном температурном режиме (таблица 2).
| Вещества | Одна проба (мкл) | 9 проб (мкл) |
| Геномная ДНК | 1 | 9 |
| dNTP | 1.5 | 13.5 |
| Буфер 10x | 2.5 | 22.5 |
| Mg2+ | 2.5 | 22.5 |
| Прямой праймер | 0.3 | 2.7 |
| Обратный праймер | 0.3 | 2.7 |
| Taq-полимераза | 0.5 | 4.5 |
| H20 | 16.4 | 147.6 |
| Общий объем | 25 | 225 |
| Таблица 1. Пример прописи для ПЦР реакции для 1 и для 9 пробирок общего объема смеси 25 мкл. |
|
|
|
| Название стадии | Температура, °C | Время, с | Число циклов | |
| Предварительная денатурация | 95 | 90 | 1 | |
| Денатурация | 95 | 50 | 35 | |
| Отжиг | 56-68 | 40 | ||
| Элонгация | 72 | 45 | ||
| 72 | 180 | 1 |
2.2.4 Электрофорез ПЦР-продуктов в 1,5% агарозном геле.
Гель-электрофорез – метод разделения смеси молекул ДНК по размеру. Он основан на том, что молекулы ДНК в буферном растворе заряжены отрицательно и под действием электрического поля движутся к аноду. Если электрофорез проводится в агарозном или полиакриламидном геле, то поры геля обладают эффектом сита, и в результате малые молекулы движутся к аноду быстрее, чем большие. Разделяющая способность геля зависит от размера пор, который в свою очередь, зависит от концентрации геля. Например, в 5%-й агарозный гель позволяет фракционировать молекулы ДНК размером 100-500 п.н., в то время как в 0,5%-м можно разделить молекулы размером 5-20 тыс. п.н. Полиакриламдные гели (ПААГ) используются для фракционирования фрагментов ДНК меньшего размера, вплоть до фрагментов, различающихся между собой на несколько нуклеотидов. Положение отдельных молекул ДНК при электрофорезе оценивают с помощью красителей бромфенолового синего и ксиленцианола.
В настоящей работе разделение ПЦР-продуктов по молекулярной массе проводили с помощью горизонтального агарозного 1,5% геля. Он готовиться на основе ТАЕ или ТБЕ буфера. К 1,5 гр агарозы добавляется 100 мл буфера и доводится до полного растворения в микроволновой печи. После чего, в полученный жидкий гель добавляется 8-10 мкл бромистого этидия на 100 мл продукта для последующего проявления в ультрафиолете. Гель быстро заливается в приготовленную плашку и инкубируется в течение получаса до полного охлаждения. Электрофорез проводили при постоянной силе тока в 400 мА с использованием камеры для горизонтального фореза (“Хеликон”, Москва) в течение 20-30 минут. Визуальный контроль миграции ПЦР-продуктов осуществли относительно положения красителей бромфенолового синего и ксиленцианола. После чего гель помещали на трансиллюминатор, где оценивали результат.
Очистка ПЦР продукта.
Это группа методов для очистки ПЦР продукта от остатков dNTP, несвязавшихся праймеров и «лишних» амплифицрованных участков ДНК. Очистка используется для подготовки ПЦР продукта к секвенированию и ряда других исследований, налагающих жесткие условия на «чистоту» образца. Существует множество методов очистки ПЦР продукта. Каждый из них имеет свои положительные и отрицательные стороны, которые
2.2.5.1 Метод элюции ДНК из агрозного геля с помощью центрефугирования.
Этот метод является одним из основных для подготовки ПЦР продукта к секвенированию. Его безусловный плюс состоит в универсальности. Используя метод элюции из агарозного геля ПЦР продукта можно гарантировать результат при неотработанных новых условиях реакции и больших контаминациях ПЦР микса. Но у этого метода есть и недостатки: во-первых, он достаточно труден в осуществлении при отсутствии необходимого опыта и сноровки, а во-вторых, выход очищенного ПЦР продукта гораздо меньше, чем в остальных методах.
Принцип метода – после проведения электрофореза на агарозном геле необходимо найти «полосу» фрагмента необходимой длины. Это производится относительно заводского маркера или же окрашенной плазмиды. После нахождения фрагмент вырезается и помещается минимум на час в морозильник на -4 для охлаждения. Далее вырезанный кусочек геля помещается в колонку и откручивается на центрифуге 5 минут при 12000хg. К получившемуся осадку добавляют двойной объем 96% этилового спирта, после чего центрифугируют 15 минут при 12000xg. В результате, в пробирке будет осадок содержащий ДНК. Необходимо изъять спирт из пробирки при помощи микропипетки или водяного насоса и поставить ее инкубировать в термостат при 37°С. После того как весь спирт испариться к осадку добавляют 10 мкл бидистилированой воды.
2.2.5.2 Использование Illusta MicroSpin Kit.
Этот метод хотя и проще описанного выше, но требует определенной подготовки ПЦР продукта. Набор реактивов удаляет остатки dNTP и несвязавшиеся праймеры. Таким образом, ПЦР продукт должен быть «чистым» от неспецифически амплифицированных участков. Принцип метода – ресуспензировать колонку с гелем (заводской комплект) на вортексе. Оторвав «хвост» и приоткрыв крышку колонки, поместить ее в 1,5 мл пробирку. Центрифугировать 1 минуту при 735xg. Добавить на поверхностность застывшего геля 25-100мкл ПЦР продукта, поместить колонку с гелем в новую пробирку. Центрифугировать 2 минуты при 735xg. Полученный фильтрат в пробирке является очищенным ПЦР продуктом.
2.2.5.2 Использование ферментов SAP и Exo1
Эти ферменты удаляют dNTP и одноцепочечные последовательности (праймеры). Принцип метода похож на описанный выше, только занимает несколько больше времени. Вначале к каждым 15 мкл продукта добавляют 5 ЕА SAP и 2 EA Exo1. После быстрого перемешивания на вортексе необходимо инкубировать смесь при температуре 37°С в течение часа. Далее, для инактивации ферментов следует инкубировать смесь в течение 15 минут при температуре 75°С. Полученная смесь и является очищенным ПЦР продуктом, который можно хранить до 5 месяцев при температуре 4°С.
Секвенирование.
В основе метода секвенирования ДНК, разработанного Сэнгером и соавт. [Sanger et al., 1977], называемого также методом секвенирования путем терминации цепи, лежит принцип ферментативного построения комплементарной цепи ДНК по существующей одноцепочечной матрице при происходящем в разных местах цепи ДНК ингибировании ее дальнейшего роста. Изначально этот метод был не автоматизирован и состоял из множества этапов:
1) Гибридизация изучаемого фрагмента ДНК с праймером,
2) Ферментативный синтез ДНК,
3) Денатурация полученных продуктов формамидом (в результате образуются уникальные различающиеся по длине олигонуклеотидные последовательности, содержащие праймер),
4) Электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках (по числу типов нуклеотидов)
5) анализ результатов на радиоавтографе. На большинстве радиоавтографов можно было четко различить 250—350 полос, т.е. прочитать последовательность в 250-350 п.н.
Сейчас очень распространены автоматические секвинаторы, которые позволяют ускорить процесс и сократить число этапов. Общая схема секвинирования выглядит так:
1) Выделение ДНК (пункт 2.2.2)
2) Постановка ПЦР для увеличения числа копий нужного фрагмента (пункт 2.2.3)
3) Очистка ПЦР продукта от dNTP и остатков праймеров (пункт 2.2.5)
4) Постановка сиквенсовой реакции (описано будет ниже)
5) Обнаружение флуоресцентно меченых меток при помощи аппарата для секвинирования
6) Анализ результатов
Подробнее остановимся на сиквиенсовой реакции. По своей сути эта реакция напоминает обычную ПЦР, но с использованием флуоресцентно меченым ddNTP.
ПЦР-микс для сиквиенсовой реакции готовится из очищенного амплификата с добавлением отдельно forward и reverse праймеров (3,2 пикаМоль), заводского реагента RR 5х, включающего в себя ddNTP, dNTP, Mg2+, полимеразу, (20% от объема смеси), специального 10х буфера ( 10% от объема смеси) и воды milli-q.
Первый этап сиквенсовой реакции – денатурация, во время этой стадии происходяит расхождение двойной цепочки ДНК. Это осуществляется в результате нагревания раствора содержащего ДНК до 95°С.
Второй этап – отжиг праймеров. В некоторых вариациях во время этого этапа в каждую пробу можно добавлять только один праймер (forward или reverse). Таким образом, можно «перестраховаться» и в спорных ситуациях анализировать фрагмент как в прямом направлении, так и в обратном. Температура и время отжига аналогичны таковым при постановки ПЦР.
Третий этап – элонгация праймера. В этом этапе заключается главное отличие сиквенсовой реакции от ПЦР. В пробирке кроме dNTP, которые комлиментарно достраивают цепочку ДНК находится малая доля и ddNTP. У этих молекул нет кислородной группы в 3’ положении и они флюрисцентно мечены. Первое свойство ddNTP позволяют останавливать элонгацию цепи, так как dNTP не может образовать связи с ddNTP. Второе же свойство используется в дальнейшем для детекции нуклеотидов. В результате третьего этапа в пробирке будет ДНК с одной полной цепью и с комплиментарной ей неполной, начинающейся от праймера (forward или reverse) и заканчивающаяся меченым ddNTP.
Перейдем к описанию генетического анализатора на примере используемого в этой работе 3130 Applied Biosystems Genetic Analyzer. Это устройство представляет собой камеру для вертикального гель электрофореза. Предварительно денатурированная ДНК после сиквенсовой реакции раскапывается в плашку из 96 ячеек. После чего происходит настройка прибора и его запуск. В настройку входит наименование проб, выбора алгоритма секвенирования и обработки результатов (обычно это заводские настройки). После запуска происходит электроинъекция ДНК в капилляры, содержащие гель. Изменяя напряжение создаваемое во время «впрыска», можно регулировать объем ДНК единомоментно поступивший в капилляр. В качестве геля используется ПААГ (концентрация обычно в пределах 4,5-6%), Электрофорез происходит в капиллярах диаметром 50-100 мкм. В капиллярах ДНК движется с разной скоростью – чем она меньше, тем быстрее движется. Таким образом, чем раньше к праймеру присоединился ddNTP, тем быстрее этот фрагмент пройдет через детектирующую ячейку. Капилляры просвечиваются лазером (рисунок 3.), возникающее при этом излучение флюоресценции от меченых ddNTP определенного цвета (и постепенно изменяющейся интенсивности) проецируется оптической системой на входную щель спектрофотометра и падает на отражающую дифракционную решетку. В зависимости от длины волны флюоресценции дифракционная решетка отражает цветной луч в определенное положение на выходе спектрофотометра. Информация об этом положении поступает в компьютер, обеспечивая идентификацию дидезоксирибонуклеотида, которым заканчиваются данные отрезки ДНК (таблица 2). Выходя из спектрофотометра, луч попадает в камеру для измерения его интенсивности, где используется явление фотоэлектронной эмиссии. Соответствующий электрический сигнал также поступает в компьютер.
| Рисунок 2. Движение ДНК в капилляре. 1)меченое ddGTP, 2)меченое ddATP, 3)меченое ddCTP, 4)меченое ddTTP, 5) немеченая часть ДНК, 6) капилляр, 7) лазер, стрелкой указано направление движения ДНК |
| Таблица 3. Пример меченых ddNTP. |
Далее следует проанализировать полученные результаты. В данном исследовании мы использовали программы Chromas pro и LaserGene. С их помощью можно сравнить полученную последовательность нуклеотидов у больного с таковой же у здоровых людей (рисунок 3). Метод позволяет анализировать фрагменты длиной порядка 800 п.н. Нами было исследовано 10 экзонов длиной 200-600 п.н. Мутаций и полиморфизмов обнаружено не было.
| 1) |
| 2) |
| 3) |
| 4) |
| 6) |
| 5) |
1) позицию выбранного участка относительно референсного (исходного, здорового) гена,
2) последовательность нуклеотидов у референсного гена, 3) последовательность нуклеотидов, полученную при секвенировании, 4) направление элонгации (было амплифицировано с прямого или обратного праймера), 5) графики флуорисценции меченых ddNTP, 6) названия сиквенсовых проб.
ПЦР в реальном времени.
Этот метод является одним из видов ПЦР. С его помощью можно наблюдать результат амплифицирования во время реакции, а не только по окончанию всех циклов. Это стало возможным благодаря встраиванию флуоресцентной метки в амплифицируемую ДНК. Флуоресцентный краситель может быть встроен в праймер вместе с «гасителем». Когда проходит амплификация «гаситель» отрывается полимеразой и праймер начинает флуоресцировать, так называемые красители для меченых олигонуклеотидов. В этой работе был использован иной метод окрашивания. Флуоресцентный краситель Sybr Green I присоединяется к двухцепочечному фрагменту ДНК и начинает поглощать свет в средневолновой области (λmax = 497 нм) и испускать свет с максимальной длиной волны 520 нм (рисунок 4). Это так называемый дуплекс-специфичный интеркалирующий краситель.
Рисунок 4. Зависимость доли максимальной флуорисценции поглощения или испускания Sybr Green I от длины волны.
Сущность реакции ПЦР в реальном времени состоит в следующем – есть область гена, которую фланкируют праймеры (реверс и форвард), эта область множество раз копируется и накапливается ДНК соответствующей длины. Причем за каждый цикл количество продукта увеличивается в 2 раза. Реактивы, использующиеся для ПЦР в реальном времени по сути такие же как и в обычной ПЦР, но в данном эксперименте была использована готовая смесь вместе с красителем (туда входят полимераза, буфер, Mg2+, dNTP, краситель). Пример прописи для ПЦР в реальном времени представлен в таблице 4. Программа для амплификации ПЦР в реальном времени несколько отличается от стандартной, не считая того, что в ней присутствует стадия, в которой происходит считывание флуорисценции (обычно это стадия элонгации), стадии элонгации и отжига праймеров совмещены (пример - таблица 5).
| Реактив | 1х, мкл | 8х, мкл |
| SYBR mix | 12.5 | 100.0 |
| Pr. F | 0.3 | 2.4 |
| Pr. R | 0.3 | 2.4 |
| ДНК | 1 | 8 |
| H2O | 10.9 | 87.2 |
| Общий объем | 25 | 200 |
| Таблица 4. Пример прописи для ПЦР реакции в реальном времени для 1 и для 8 пробирок общего объема смеси 25 мкл. |
| Название стадии | Температура, °C | Время, с | Число циклов |
| Предварительная денатурация | 95 | 180 | 1 |
| Денатурация | 95 | 10 | 39 |
| Отжиг и элонгация* | 58 | 30 |
| Таблица 5. Пример программы амплификации для ПЦР в реальном времени. Звездочкой обозначена стадия, в которой происходит считывание значения флуорисценции. |
Прибор, используемый для проведения ПЦР в реальном времени является модифицированным амплификатором (общая схема - рисунок 7). Считываемое значение флуорисценции заносится на прямую в компьютер, где программа обсчитывает результат и строит график (условный график – рисунок 8)
| Рисунок 5. Схема организации детектирующего амплификатора 1 — пробирки; 2 — термоэлектрические (ТЭ) модули (элементы Пельтье); 3 — радиатор; 4 — зеркало; 5 — источник света возбуждения флуоресценции; 6 — светофильтр источника возбуждения; 7 — детектор излучения флуоресценции; 8 — светофильтр детектора; 9 — излученный световой поток; 10 — световой поток возбуждения; 11 — суммарный световой поток; 12 — спектроделитель |
Флуоресценцию, получаемую при использовании метода риалтайм ПЦР, можно представить следующим графиком (рисунок 6). На условной кривой флуоресценции можно различить несколько областей. Во-первых, это область первоначального накопления продукта, когда флуоресцирует изначальная ДНК и ее количество меняется не значительно, а шумы и погрешности аппарата примерно сопоставимы с самим сигналом. Этот период при обсчете данных обычно отсекают и учитывают значение. Далее идет период экспоненциального роста флуоресценции. В этот период определяют линию threshold, которая проходит на уровне начала видимого подъема флуоресценции. Эту линию легче всего найти по логарифмическому графику (рисунок 7), хотя при правильной настройке программное обеспечение устройства для риалтайм ПЦР может само ее нарисовать. Значение цикла в точке пересечения линии threshold и графиком флуоресценции называется точкой C(t). Это значение может быть как целым, так и дробным. Потом идет участок графика, когда значение флуоресценции приближается к своему максимальному значению – это так называемая область плато. Максимальное значение флуоресценции для исследования не играет большой роли, так как оно образуется в результате истощения реактивов и зависит от множества факторов: изначальной концентрации ДНК, количества праймеров, активности и количества полимеразы и тд.
| Рисунок 6. Примерный график зависимости флуоресценции меченой ДНК от цикла ПЦР реакции. Зеленой зоной отмечен период накопления флуоресценции, когда идет незначительное увеличение продукта и уровень «шума» сопоставим с уровнем сигнала. Красным обозначен период экспоненциального роста - интенсивного увеличения копий ДНК. Через точку «проявления » ДНК проведена threshold line, по которой определяется С(t). Желтым отмечена фазу плато, когда в связи с определенными обстоятельствами (нехватка dNTP, праймеров, полимеразы, разрушение матричной ДНК после многочисленных нагреваний и пр.) флуорисценция увеличивается не так стремительно и ее значение стремиться к константе |
| Рисунок 7. Примерный график зависимости логарифма флуоресценции меченой ДНК от цикла ПЦР реакции. Зеленой зоной отмечен период накопления флуоресценции. Красным обозначен период экспоненциального роста. Через точку «проявления » ДНК проведена threshold line. Желтым отмечена фаза плато. |
Обсчет данных, полученных методом ПЦР, был произведен при помощи программного обеспечения компании Bio Rad (CFX Manager 1000 v1.6), входившего в комплект поставки амплификатора для риалтайма и при помощи пакета программ Microsoft Excel. Для нахождения threshold line и определения значений C(t) была использована программа CFX Manager 1000. А для обработки этих значений и выявления статистической достоверности данных был применен Microsoft Excel.
3.Результаты и обсуждение
Для диагностики использовали периферическая кровь пациента. После выделения ДНК из крови (раздел 2.2.2) была проведена ПЦР (раздел 2.2.3). Ген FKTN состоит из 10 экзонов, каждый из которых анализировали отдельно. После проведения ПЦР и постановки электрофореза (рис. 8) были выбраны пробы, которые давали достаточно сильный и чистый сигнал. На втором этапе эти пробы были очищены от остатков праймеров и dNTP (раздел 2.2.5). Далее было проведено сиквенирование экзонов (раздел 2.2.6). Был проведен анализ данных секвенирования при помощи программ LaserGene и Chromas pro. Этот анализ не выявил мутаций в экзонах (рис. 9).
| 3 |
| 7 |
| 8 |
| 9 |
| 6 |
| 4 |
| 2 |
| 1 |
| 10 |
| 10 |
| 5 |
Рисунок 8. Пример ПЦР.1 – первый экзон, 2 – второй экзон, 3 – третий экзон, 4 – четвертый экзон, 5 – пятый экзон, 6 – шестой экзон, 7 – седьмой экзон, 8 – девятый экзон, 9 – десятый экзон, 10- маркер молекулярного веса (леддер)
В публикациях отмечена относительная редкость мутаций в экзонах, в тоже время была отмечено достаточная частота инсерции ретранспозона в 3’ нетранслируемую область. Для определения инсерции в 3’ нетранслируемой области был использован метод Real time PCR (раздел 2.2.7).
| Рисунок 9. Примеры секвенирования экзонов. Римскими цифрами обозначен номер экзона. Мутаций ни в одном не обнаружено. |
Для статистической достоверности было взято 6 одинаковых ПЦР миксов. Пробы были сделаны по стандартной прописи (таблица 4). Первая группа из 6 проб содержала ДНК больного и праймеры на транспозон, аналогично сделана группа с ДНК здорового человека, вторая группа проб содержала ДНК больного и праймеры на контрольный ген SALL4 (его копийность известна), аналогичная группа и для ДНК здорового человека.
В результате проведения ПЦР в реальном времени получили ряд данных, которые обработали с помощью программы CFX Manager 1000 (рисунок 10). Значение С(t) было занесено в Microsoft Excel, где использовали формулу для сравнения экспрессии ДНК:
Xtest/Xcontrol = 2ddC(t) , где
Xtest - содержание тестируемого фрагмента у больного
Xcontrol – содержание фрагмента у здорового
ddC(t) = dC(t) здорового - dC(t) больного
dC(t) здорового = С(t)с праймерами для транспозона здорового - С(t)с праймерами для контрольного гена здорового
dC(t) больного = С(t)с праймерами для транспозона больного - С(t)с праймерами для контрольного гена больного
| Рисунок 10. Окно программы CFX manager. Цифрой 1 обозначено поле, на котором размещен график зависимости флуоресценции от номера цикла, цифрой 2 обозначено зона выбора пробирки с образцами, цифрой 3 – зона данных, в частности в ней обозначено значение с(t) |
| 3) |
| 2) |
| 1) |
Подтвердили статистически приемлемый характер распределения значений С(t) среди одинаковых проб (рисунок 11). Также было проведено сравнение между разбросом С(t) с испольщванием праймеров для контрольного гена SALL4 у больного и у здорового с использованием критерия Стьюдента, аналогично для проб с праймерами на транспозон. Статистическая обработка показала, что с только доверительной вероятностью 0,8 пробы с праймерами для контрольного гена SALL4 у здорового и больного человека будут различны и находиться в разных совокупностях. В тоже время пробы с праймерами для транспозона у больного и здорового человека с уровнем значимости 0,999 имеет различия (что собственно и ожидалось).
| Рисунок 11. Значение среднего С(t) для различных проб со стандартным отклонением. |
E = 101/a , где
Е- эффективность амплификации
а- коэффициент линии тренда
| Рисунок 12. Окно программы CFX manager. Цифрой 1 обозначено поле, на котором размещен график зависимости флуоресценции от номера цикла, цифрой 2 обозначено зона выбора пробирки с образцами, цифрой 3 – зона данных, в частности в ней обозначено значение с(t), цифрой 4 обозначено окно построения графика зависимости С(t) от log10(концентрация образца). |
| 4) |
| 3) |
| 2) |
| 1) |
В результате обсчетов было обнаружено, что эффективность амплификации у больного примерно такая же, даже несколько меньше, чем у здорового человека. Это говорит о том, что наши данные о наличии перемещения транспозона верны не только статистически.
Таким образом, можно с уверенностью говорить о том, что пациент страдает синдромом Фукуямы.
4.Выводы
- Данные секвенирования не показали наличия мутаций в кодирующей области гена FKTN
- Была обнаружена инсерция ретранспозона в 3’ нетранслируемую область.
- По совокупности данных можно говорить о том, что пациент страдает синдромом Фукуямы.
5. Список литературы
- Херрингтон С., Макги Д. Молекулярная клиническая диагностика. Перевод с английского. – 1999. – М.: Мир, 558 с.
- Примроуз С., Тваймен Р. Геномика. Роль в медицине. Перевод с английского. – 2008. – Бином. Лаборатория знаний С. 16-20.
3. Ребриков Д.В. ПЦР «в реальном времени», 2009. - Бином. Лаборатория знания, 223с.
4. http://omim.org/entry/607440?search=FCMD&highlight=fcmd дата обращения - 29.08.2011
5. http://gene-quantification.com/ дата обращения – 29.08.2011
6. Watanabe, M., et al., Founder SVA retrotransposal insertion in Fukuyama-type congenital muscular dystrophy and its origin in Japanese and Northeast Asian populations. Am J Med Genet A, 2005. 138(4): p. 344-8.
7. Kobayashi, K., et al., An ancient retrotransposal insertion causes Fukuyama-type congenital muscular dystrophy. Nature, 1998. 394(6691): p. 388-92.
8. Yis, U., et al., Fukutin mutations in non-Japanese patients with congenital muscular dystrophy: less severe mutations predominate in patients with a non-Walker-Warburg phenotype. Neuromuscul Disord, 2011. 21(1): p. 20-30.
Дата добавления: 2021-01-20; просмотров: 97; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!