ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ МИКРОБОВ
Занятие 4. Методы выявления и изучения морфологических и культуральных свойств микробов. Микроскопия в светлом поле. Методы приготовления и окрашивания фиксированных препаратов. Размеры микроорганизмов. Изучение нативных препаратов микроорганизмов. Препараты висячая и раздавленная капля.
Морфологические свойства микроорганизмов можно обнаружить используя разные методы микроскопирования. Наиболее доступным является использование светового микроскопа.
Исследование микробов в окрашенном состоянии
Изучение морфологии микробов в окрашенном состоянии является наиболее распространенным в микробиологии методом. Этот метод имеет много достоинств:
- позволяет изучить морфологические особенности микробов и дает возможность найти различия между ними, а иногда даже точно определить изучаемый микроорганизм;
- удобен в практической работе, так как значительно легче производить исследование, пользуясь убитыми микробами, чем живыми (особенно при изучении патогенных микроорганизмов);
- легко доступен благодаря простоте техники окрашивания.
Приготовление окрашенного препарата включает:
а) приготовление мазка; б) высушивание мазка; в) фиксацию; г) окраску.
Препараты приготовляют на совершенно чистых предметных стеклах. Стекло может быть признано чистым, если помещенная на него капля воды легко расплывается по поверхности, а не принимает шаровидную форму или распадается на отдельные капельки.
|
|
|
Очень простой способ очистки вымытого стекла — натереть его кусочком мыла и вытереть досуха ватой.
а) Приготовление мазка. Мазок должен быть тонким, так как только при этом условии он удобен для изучения микробов.
Для приготовления мазка на середину чистого предметного стекла наносят небольшую каплю воды и помещают в нее исследуемый материал. Если препарат приготовляют из культуры на плотной среде, то, соблюдая правила асептики, берут петлей немного материала и погружают в каплю, слегка растирая в ней, а остаток культуры в петле сжигают на пламени горелки.
б) Высушивание. Препарат высушивают при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает равномерно и быстро.
Если же высушивание препарата замедлено, то препарат подогревают, держа стекло мазком вверх, в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки. Это нужно производить крайне осторожно, не допуская перегревания мазка, так как при этом может произойти слишком быстрое и грубое свертывание белков в цитоплазме микробов, что нарушит их структуру. Если препарат высушен не полностью, то при фиксации он окажется также испорченным; если высушиваемые препараты содержат заразный материал, их накрывают стеклянным колпаком, особенно летом, во избежание переноса микробов мухами и порчи самого препарата.
|
|
|
в) Фиксация. Фиксация препарата имеет целью: 1) убить микробов и сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; 2) прикрепить мазок к стеклу, чтобы он не смывался при дальнейших манипуляциях; 3) сделать микробов более восприимчивыми к окраске, там как убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. При фиксации следует предупреждать грубые изменения нормальной клеточной структуры и избегать образования ложных структур (артефактов).
Способов фиксации существует много. Наиболее простым, пригодным почти для всех объектов и самым распространенным в микробиологии является фиксация жаром—нагреванием на пламени горелки. Большим и указательным пальцами препарат берут за край стекла мазком вверх и несколько раз проводят через наиболее горячую часть пламени горелки (на границе светлой и темной его части). При этом рука, которая держит препарат, описывает трижды круг диаметром 25 см.
Вся манипуляция занимает 5—6 секунд, причем препарат подвергается действию пламени не более 2 секунд. Быстрота и кратность проведения препарата через пламя регулируются ощущением жжения: если препарат хорошо зафиксирован, то стекло при легком прикосновении им к тыльной поверхности левой руки тотчас по окончании фиксации слегка обжигает кожу.
|
|
|
При излишнем перегревании мазок портится, вследствие сильного изменения структуры клеток; недостаточная же фиксация не достигает цели, так как мазок смывается при последующей обработке.
г) Окрашивание мазков. Окрашивание микробов не является механическим процессом проникновения краски в микробную клетку. Механизм окраски микробов следует рассматривать как процесс физико-химический. Соединение микроба с краской является в большинстве случаев весьма стойким, не поддается разрушению или простому вымыванию водой; нередко различные виды микробов по-разному реагируют с одними и теми же красками, что свидетельствует о неодинаковом химическом составе их цитоплазмы. В ряде случаев различные составные части микробной клетки избирательно окрашиваются разными красящими растворами. Наиболее пригодными для окраски микробов оказались анилиновые краски, главным образом основные и нейтральные. Кислые краски менее пригодны.
|
|
|
Окраска мазка производится после фиксации. Если мазок тонкий и трудно определить, на какой стороне стекла он находится, достаточно подышать на стекло, чтобы мазок явственно выступил, тогда как вся поверхность стекла, где мазка нет, равномерно запотевает. Можно также слегка поцарапать мазок петлей: от нее останется след.
Количество краски должно быть таким, чтобы покрыть всю поверхность мазка; достаточно нескольких капель краски, наливаемых при помощи пипетки. По истечении срока окрашивания краску сливают с препарата и промывают его легкой струёй воды. При этом со стекла смывается только лишняя краска; краска же, адсорбированная микробами, остается. Оставшуюся на стекле воду осторожно удаляют, или отсасывая ее краем фильтровальной бумаги, или слегка прижимая кусочек бумаги к мазку. Окрашенный мазок должен быть совершенно сухим, так как остаток воды образует с иммерсионным маслом, нанесенным на мазок, эмульсию, мешающую микроскопированию.
ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ МИКРОБОВ
В лабораторной технике пользуются простыми и сложными методами окраски микробов. Простым методом окраски называют окраску препарата одной какой-либо краской. К таким методам относится окраска разведенным фуксином или щелочной метиленовой синькой.
Окраска разведенным фуксином. На предметном стекле готовят мазок и фиксируют его на пламени горелки. Затем на охлажденный препарат на 1—2 минуты наливают разведенный фуксин. Краску промывают водой и препарат высушивают.
Окраска щелочной метиленовой синькой. На предметном стекле готовят мазок и фиксируют его на огне. На остывший мазок наливают метиленовую синьку на 2—3 минуты. Краску смывают водой и препарат высушивают. При окраске синькой дифференцируются ядро и цитоплазма, а потому при окраске материала (гной, экссудат и т. д.) целесообразнее употреблять метиленовую синьку.
СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ
При сложных методах окраски микробов на один и тот же препарат воздействуют несколькими растворами. К сложным методам относится окраска по Граму, Циль-Нильсену, по Нейссеру и т. д
Окраска микробов по методу Грама (Кристиан Грам, 1884). Все микробы по их отношению к окраске по методу Грама делятся на две группы:
а) грампозитивные, или грамположительные;
б) грамнегативные, или грамотрицательные.
Различное отношение к окраске по Граму зависит от разницы в физическом и химическом строении самих бактерий. Для окраски по классическому методу Грама необходимы следующие растворы
1) карболовый генцианвиолет;
2) раствор Люголя (иод кристаллический 1 г, йодистый калий 2 г и дистиллированная вода 300 мл; иод и йодистый калий смешивают и растворяют в 5 мл воды, а затем добавляют остальную воду);
3) спирт 96°;
4) разведенный фуксин
Техника окраски по Граму следующая. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, по размеру равный сделанному мазку. На эту бумажку наливают раствор генцианвиолета на 1—2 минуты. Сливают краску с бумажкой и, не промывая препарат водой, наливают на 1—2 минуты раствор Люголя до полного почернения мазка. Затем раствор Люголя сливают и на 1/2—1 минуту наливают 96° спирт (при этом препарат надо покачивать). Промывают водой и дополнительно окрашивают разведенным фуксином (1—2 минуты). Сливают краску, промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Видоизмененный способ Грама (по А. Синеву). 1. На фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумажки, пропитанной 1 % спиртовым раствором генцианвиолета.
2. Наносят на бумажку 2—3 капли воды и оставляют на 2 минуты.
3. Снимают бумажку пинцетом и наливают раствор Люголя на 1—2 минуты.
4. Обесцвечивают спиртом (10—30 секунд).
5. Дополнительно окрашивают разведенным фуксином (1—2 минуты).
Образующийся красящий комплекс генцианвиолет + йод окрашивает клетки в фиолетовый цвет. Если клетки не обесцвечиваются спиртом то они сохраняют эту окраску и являются грамположительными (Гр+). Если же при обесцвечивании спиртом клетки теряют красящий комплекс – они считаются грамотрицательными (Гр-).
Негативные способы окраски препаратов. При этих способах исследуют микробов в неокрашенном виде, в то время как весь фон препарата окрашен каким-либо веществом, которое при приготовлении мазка распределяется на стекле вокруг микробов, но не адсорбируется ими. На окрашенном фоне ярко выделяются неокрашенные тела микробов, с точно обрисованными контурами.
Способ Бурри. Исследуемый материал смешивают с тушью; следовательно, микробы рассматриваются на черном фоне. Мазок приготовляют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю туши, а рядом с ней — каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно, но быстро (чтобы не дать им высохнуть) перемешивают. Из полученной смешанной капли приготовляют мазок обычным способом. Когда мазок высохнет, его фиксируют в пламени горелки и рассматривают его с иммерсионной системой. Микробные клетки обнаруживаются в виде ярко освещенных телец на темном фоне. Для ознакомления с техникой окраски по Бурри можно приготовить мазок из зубного налета, где всегда имеется много разнообразных микробов. В каплю воды, помещенную у края предметного стекла, погружают небольшой кусочек зубного налета, взятого простерилизованной и остуженной петлей у шейки зуба, и равномерно эмульгируют его в капле. Затем рядом с каплей воды помещают каплю туши. Обе капли тщательно смешивают петлей и из этой смеси делают мазок подобно мазку из капли крови. При микроскопировании наблюдается характерная флора зубного налета.
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 191; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!