Вопросы экспериментального проектирования для КПЦР
9
Singleplex или Multiplex?
9
Выбор химии
9
ДНК-связывающие красители (SYBR Green I)
10
Флуоресцентная химия на основе праймеров и зондов
12
Разработка и оптимизация реакций SYBR Green I
19
Праймер и Ампликон Дизайн
19
Проверка правильности и оптимизация
20
Оптимизация температуры отжига
20
Оценка эффективности анализа с использованием стандартных кривых
22
Разработка и оптимизация реакций на зонд TaqMan
23
Учебник для начинающих и исследования
23
Проверка правильности и оптимизация
24
Страница 12 |
начиная
Общие Соображения
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
8
2. Начало работы
Теперь, когда мы ввели понятия, лежащие в основе КПЦР в реальном времени, мы можем углубиться
в более практические вопросы. В этой главе мы предлагаем рекомендации по настройке
ваши анализы КПЦР в реальном времени, включая основные лабораторные методы (раздел 2.1),
основные экспериментальные конструкции и компоненты реакции (раздел 2.2), решающие
между одноплексным и мультиплексным анализами (раздел 2.2.1) и выбором в реальном времени
химия (раздел 2.2.2). Мы также предоставляем более подробные инструкции по настройке
Реакции КПЦР с использованием двух самых популярных химикатов, SYBR Green I
(Раздел 2.3) и TaqMan (раздел 2.4).
2.1 Общие соображения
Правильная лабораторная техника - важный, но часто пропускаемый шаг к
успешная ПЦР в реальном времени. Для достижения оптимальных результатов вы должны минимизировать потенциал
|
|
перекрестное загрязнение между образцами и предотвращение переноса нуклеиновых кислот из
один эксперимент к другому. Следующие меры предосторожности помогут вам избежать
проблемы загрязнения:
• Протирать рабочие станции разбавленными растворами отбеливателя или коммерчески
доступные решения по дезактивации
• Подготовьте образцы в специально отведенной для этого чистой комнате, вытяжке или на рабочем месте.
оснащен ультрафиолетовой лампой. В идеале это должно быть расположено в другой области
от термоциклера. Будьте осторожны, чтобы не загрязнить область плазмидами
или ампликоны; никогда не приносите продукты после усиления в назначенный
чистая зона
• Меняйте перчатки часто во время подготовки образца и настройки реакции
• Используйте защитные трубки и наконечники для аэрозольных барьеров.
• Часто чистите пипетки разбавленным раствором отбеливателя.
• Используйте только воду и реагенты для ПЦР, предназначенные только для ПЦР.
• Используйте пробирки с завинчивающейся крышкой для разбавления и настройки реакции.
Помимо принятия вышеуказанных мер предосторожности, вы всегда должны подготовить
|
|
контроль без шаблонов для ваших анализов ПЦР, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения
произошло. Кроме того, используйте полимеразу горячего старта, чтобы предотвратить неизбирательное
усиление до начала реакции.
Страница 13 |
начиная
соображения экспериментального дизайна
Чтобы свести к минимуму статистические различия в экспериментальных результатах, подготовьте мастер-миксы для
повторять реакции всякий раз, когда это возможно. Мы рекомендуем запустить все образцы в
тройные. Минимизируйте повторное замораживание и оттаивание, готовя небольшие аликвоты
запас реагента перед первым использованием.
2.2 Экспериментальные соображения дизайна
для КПЦР
Первым шагом в разработке эксперимента ПЦР в реальном времени является выбор наилучшего типа
анализа для эксперимента, представляющего интерес. Должен ли одноплексный или мультиплексный анализ
используемый? Какой тип химии в реальном времени следует использовать? В следующих
разделы, мы описываем каждый тип анализа и даем рекомендации о том, как выбрать
лучший тип анализа для вашего эксперимента.
Singleplex или Multiplex?
Как практические, так и научные причины могут заставить вас попробовать мультиплексирование,
|
|
усиление более чем одной мишени в одной реакционной пробирке. В настоящее время это
возможно усиление и количественное определение до пяти целей в одной пробирке, в зависимости от
на функции вашего инструмента ПЦР в реальном времени. Мультиплексирование дает следующее
Преимущества перед одноплексными реакциями:
• Сокращение количества необходимого стартового шаблона, что важно при
количество исходного материала ограничено
• Уменьшение количества ложных негативов, если контрольная цель усиливается в каждом образце
• Увеличение производительности лаборатории с сопутствующим снижением затрат на реагенты
• Минимизация обработки проб и связанные с этим возможности для лаборатории
загрязнение
Если ни одно из этих соображений не имеет значения для ваших анализов, то используйте однократный
реакции достаточно. Практические советы о том, как настроить и оптимизировать мультиплекс
Реакции КПЦР приведены в разделе 3.
Выбор химии
Ключевым шагом в разработке анализа КПЦР является выбор химического состава для мониторинга
амплификация последовательности-мишени. Разнообразие флуоресцентных химикатов доступно
|
|
можно разделить на два основных типа: 1) ДНК-связывающие красители (SYBR Green I),
и 2) меченые красителем, специфичные для последовательности олигонуклеотидные праймеры или зонды (молекулярные
Beacons и TaqMan, гибридизация и Eclipse-зонды, и Amplifluor, Scorpions,
Праймеры LUX и BD QZyme). Наиболее часто используемые химические препараты для ПЦР в реальном времени
ДНК-связывающие красители SYBR Green I и TaqMan для гидролиза. Мы предоставляем
обзор этих различных типов флуоресцентных химикатов в разделах 2.2.2.1–2.2.2.2.
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
9
Страница 14 |
начиная
соображения экспериментального дизайна
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены . Руководство по применению ПЦР в реальном времени
10
Химический состав, выбранный вами для анализа КПЦР, зависит от вашего применения,
выполняете ли вы одноплексные или мультиплексные реакции, и соображения стоимости.
Как правило, для одноплексных экспериментов с низкой пропускной способностью ДНК-связывающие красители могут быть
предпочтительнее, потому что эти анализы легче спроектировать, быстрее настроить и
изначально более экономически эффективны. Для экспериментов с высокой пропускной способностью, однако,
Анализ на основе флуоресцентного праймера или зонда (одноплексный или мультиплексный) может быть более
желательно, потому что первоначальная стоимость может быть распространена на многие эксперименты и
Возможность мультиплексирования может сократить время анализа. Мультиплексные анализы требуют использования
химия на основе флуоресцентных праймеров или зондов, потому что отсутствие специфичности
ДНК-связывающие красители делают их несовместимыми с количественными мультиплексными анализами.
Дата добавления: 2020-04-08; просмотров: 108; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!