Спектроскопия ядерного магнитного резонанса биомолекул. Чувствительность метода. Криодатчик.
Уровни структурной организации белковой молекулы (первичная, вторичная, третичная, четвертичная).
Белки – это линейные полимеры, структурной единицей которого (мономером) являются аминокислоты, соединенные пептидными связями.
Белки отличаются от пептидов не только количеством аминокислотных остатков, но, главное, характерной пространственной организацией белковой молекулы. Различают 4 уровня структурной организации белка: первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры.
Первичная структура белка – это последовательность аминокислотных остатков, соединенных между собой пептидными связями, в полипептидной цепи. Полностью расшифрована первичная структура многих белков. Например, инсулина, гемоглобина, миоглобина, трипсиногена, лизоцима, γ-иммуноглобулинов и др. Последовательность аминокислотных остатков задана генетически (закодирована в молекулах ДНК и РНК) и определяет более высокие уровни структурной организации белка, его физико-химические и биологические свойства.
В пространстве полипептидная цепь укладывается определенным образом, формируя вторичную структуру.
Вторичная структура – это конфигурация полипептидной цепи в пространстве, которая стабилизируется (т.е. удерживается) водородными связями между атомами водорода и кислорода пептидных группировок. Различают два основных вида вторичной структуры: α-спираль и β-складчатость
|
|
|
α-спираль - плотные витки вокруг длинной оси молекулы, один виток составляют 3,6 аминокислотных остатка, и шаг спирали составляет 0,54 нм. Водородные связи в α-спирали возникают через 3 аминокислотных остатка, между 1-м и 4-м, 2- и 5-м и т.д. остатками аминокислот. Водородные связи располагаются параллельно оси спирали.
β-структура, называемая так же структурой складчатого листа, или складчатым слоем представляет собой параллельно расположенные, вытянутые полипептидные цепи или одну полипептидную цепь, которая изгибается «сама на себя» (образуя так называемые «шпильки»). Два параллельных участка ß-структуры соединяются водородными связями, в образовании которых принимает участие только половина групп, способных к их образованию
Третичная структура – это компактная укладка полипептидной цепи в пространстве в виде глобулы или фибриллы. Формирование третичной структуры происходит за счет образования связей (ионных, ковалентных, водородных, гидрофобных), между боковыми радикалами аминокислотных остатков, расположенных на различных, достаточно удаленных друг от друга участках, полипептидной цепи.
а) ионные взаимодействия возникают между радикалами, имеющими противоположный заряд. Например, между положительно заряженным лизином и отрицательно заряженной глутаминовой кислотой.
|
|
|
б) ковалентные (дисульфидные) связи – возникают между двумя боковыми радикалами цистеина (-цис─S─S─цис-).
в) водородные связи между атомами водорода и кислорода боковых радикалов аминокислот (серина, треонина, аспарагина, глутамина и др.).
г) гидрофобные взаимодействия – возникают между неполярными радикалами аминокислотных остатков аланина, валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина, триптофана, пролина.
Форма молекул
По форме третичной структуры белки разделяются на два вида: фибриллярные(нитевидные), пептидные цепи которых расположены параллельно друг другу и глобулярные, в которых полипептидные цепи плотно свернуты в шаровидные структуры – глобулы. В образовании фибрилл могут участвовать как α-спираль, так и β-структура, то же и для глобулярных белков, в них могут входить оба типа вторичной структуры.
У глобулярных белков неполярные группы аминокислот располагаются внутри глобулы, образуя гидрофобное ядро, а на поверхности располагаются полярные группы, что облегчает взаимодействие с молекулами воды, а это обеспечивает растворимость глобулярных белков в воде и других полярных растворителях.
|
|
|
Фибриллярные белки не растворимы в воде.
Белки, состоящие из одной полипептидной цепи, имеют только третичную структуру, например, миоглобин – белок мышечной ткани, участвующий в связывании кислорода; некоторые ферменты, например, пепсин и трипсин.
Некоторые белки состоят из нескольких полипептидных цепей, каждая из которых имеет третичную структуру. Для характеристики таких белков введено понятие – четвертичная структура.
Четвертичная структура – пространственное расположение полипептидных цепей в молекуле белка. Белок, имеющий четвертичную структуру, называется олигомером, а полипептидные цепи, из которых он состоит – протомерами или субъединицами.
Стабилизируют четвертичную структуру водородные связи и гидрофобные взаимодействия, возникающие между функциональными группами протомеров. У четвертичного уровня организации белка сохраняется форма третичной структуры (глобулярная или фибриллярная). Например, гемоглобин состоит из 4-х субъединиц, каждая из которых – глобулярный белок. В целом гемоглобин так же имеет глобулярную конфигурацию. Белки волос и шерсти – кератины имеют фибриллярную третичную и четвертичную структуры.
|
|
|
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса биомолекул. Чувствительность метода. Криодатчик.
ЯМР-резонансное поглощение электромагнитных волн, обусловленное квантовыми переходами атомных ядер между энергетическими состояниями с разными ориентациями спина (магнитного момента) ядра.
Преимуществом ЯМР является то обстоятельство, что метод позволяет получать информацию о структуре и динамике молекул в растворе (в таком
состоянии они находятся в живом организме) - что принципиально важно для исследований биологических молекул. Естественно, используется и ЯМР спектроскопия вещества в кристаллическом или поликристаллическом состоянии. Но только для определенного круга задач, поскольку чувствительность метода невысока.
Метод ЯМР широко применяется в биологии и медицине в таких областях как изучение строения и свойств низкомолекулярных биологически активных соединений; определение структуры биомакромолекул (белки, нуклеиновые кислоты, углеводы); изучение динамических свойств биомолекул; установление белок-лигандных взаимодействий (ЯМР-скрининг биологически активных соединений); изучение строения и свойств биологических мембран; анализ состава биологических жидкостей (метабономика); визуализация биологических объектов (ЯМР-томография); мониторинг процессов, происходящих в живом организме (in-cell ЯМР, in-vivo спектроскопия); исследование функциональной активности мозга (f-MRI).
Метод спектроскопии ЯМР характеризуется большим числом параметров. К ним относятся химические сдвиги, на основе которых производится отнесение сигналов в спектрах и получают информацию о вторичной структуре белка; Интегральные интенсивности сигналов, которые позволяют определять количество измеряемого компонента; скорости обмена протонов на дейтерий, что дает информацию о положении водородных связей, сворачивании разворачивании молекулы белка и нуклеиновых кислот; константы спин-спинового взаимодействия (через химическую связь), дающие характеристики химических связей, двугранных углов водородных связей; ядерные эффекты Оверхаузера (взаимодействие через пространство), на основе которых напрямую определяются расстояния между магнитными ядрами, отстоящие друг от друга на расстоянии до 5Å, а также определяются динамические и кинетические характеристики; ширины спектральных линий, времена, релаксации ядер и кросс-релаксации, несущие информацию о динамике молекулы и конформационных переходов в молекуле; константы диполь-дипольного взаимодействия, анализ которых дает информацию о динамических эффектах и ориентации белковых доменов и биологических молекул в целом.
Создание криодатчиков привело к самому заметному увеличению чувствительности в ЯМР исследованиях. Есть два вида криодатчиков: один основан на замкнутом цикле охлаждения гелием, другие на открытом цикле охлаждения жидким азотом. Хотя температура катушки в первом случае значительно ниже, принцип работы одинаков:
Катушки приема/передачи, а также согласующие цепи работают при очень низкой температуре, уменьшая шум от хаотического теплового движения электронов в проводниках (шум Джонсона-Найквиста). Кроме того, сопротивление металла понижается, ещё сильнее уменьшая шум. Предусилитель, фильтры и переключатель режима приема/передачи также охлаждаются с целью снижения коэффициента шума от электронных компонентов.
Уменьшение влияния шума датчика и электроники увеличивает соотношение сигнал/шум до пяти раз для гелия и два-три для жидкого азота сравнению с аналогичным датчиком комнатной температуры. Это может повысить на порядок производительность спектрометра.
Дата добавления: 2020-01-07; просмотров: 473; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!