Иммунологические методы выявления специфических антигенов
Методы, направленные на выявление специфических антигенов, являются наиболее перспективными для ранней диагностики инфекций, обусловленных иерсиниями. Основное их преимущество – быстрота получения результатов при высокой чувствительности.
В настоящее время для выявления антигенов иерсиний в различных субстратах используются:
· «диагностикумы коагглютинирующие псевдотуберкулезные и иерсиниозные» для реакции коагглютинации (РКоА), предназначенные для выявления микробных антигенов, а при подращивании – живых возбудителей в материале от больных (испражнения, моча, слюна) на первой неделе болезни, а также антигенов, связанных в составе иммунных комплексов;
· диагностикум латексный для выявления Yersinia pseudotuberculosis «Псевлат» для реакции агглютинации латекса (РАЛ). Реакцию используют для выявления антигенов возбудителя псевдотуберкулеза в копрофильтратах больных и смывах с объектов внешней среды;
· «Тест-система иммуноферментная для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза I серотипа»;
· материал для исследования, сроки и правила его взятия представлены в табл. 4 (аналогично подготовке материала для бактериологического метода).
Исследования проб проводят в первые сутки их получения и затем на 3—5 сут. после подращивания при 4 °С в ПК среде. Непосредственно перед исследованием материал инактивируют 30 мин при (56 ± 1) оС, центрифугируют при 3 000 об./мин 15 мин и берут для исследования надосадочную жидкость. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.
|
|
|
Молекулярно-генетические методы
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет выявить генетические детерминанты, локализованные на плазмиде вирулентности pYV или хромосоме, кодирующие ряд факторов патогенности.
Основная трудность ПЦР заключается в том, что при исследовании биологического материала и объектов окружающей среды реакция может ингибироваться биологическими продуктами деградации тканей, ферментами, полисахаридами и другими компонентами исследуемого материала. Поэтому перед постановкой реакции необходимо подготовить пробы к исследованию (т. е. выделить тотальную ДНК).
Подготовка проб.
Кровь. 50 мкл нативной крови смешивают со 100 мкл лизирующего буфера (10 мМ Трис-НСl, рН 8,0, 0,5 % Твин-20, 100 мкг/мл протеиназы К) и инкубируют 1 ч при 56 °С, затем протеиназу К инактивируют 10 мин при 95 °С, смесь центрифугируют 3 мин при 5 000 об./мин. Для анализа в ПЦР достаточно 2—3 мкл надосадочной жидкости.
Моча. 10—20 мл мочи центрифугируют 10 мин при 2 000 об./мин. К осадку добавляют 300 мкл стерильной дистиллированной воды и прогревают при 100 °С 10 мин. Центрифугируют при 5 000 об./мин. Для исследования в ПЦР берут 1—3 мкл надосадочной жидкости (38).
|
|
|
Вода. 1,0—2,0 л воды фильтруют через 0,22 мкм бумажный фильтр. Затем фильтр измельчают и погружают в 300 мкл метанола на 15 мин. После высушивания под вакуумом к измельченному образцу добавляют 300 мкл стерильной дистиллированной воды, прогревают при 100 °С 5 мин, центрифугируют при 5 000 об./мин 5 мин. Для исследования в ПЦР берут 1—3 мкл надосадочной жидкости.
Испражнения, помет грызунов, тонкий кишечник грызунов, смывы с объектов окружающей среды, почва. Подготовка материала основана на использовании щелочной обработки, при которой большая часть индигенной микрофлоры погибает и удаляется как супернатант при центрифугировании, а относительно устойчивые к щелочи иерсинии выживают, что обеспечивает снижение концентрации ингибиторов в пробе:
1) исследуемый материал суспендируют в ФБР в соотношении 1 : 10 и центрифугируют при 500—1 000 об./мин 1,5—2 мин для осаждения грубых частиц или отстаивают 2—3 ч при комнатной температуре;
2) 0,2—0,5 мл верхней фазы переносят в лунку полистиролового планшета для серологических реакций и смешивают с таким же объемом 0,72 % КОН;
3) после 25—30 с экспозиции проводят посев материала на СБТС и сразу же в лунки планшета добавляют 0,2—0,5 мл бульона Хоттингера для прекращения действия щелочи, как селективного агента;
|
|
|
4) материал из лунки переносят в пробирку типа «Эппендорф» и центрифугируют на микроцентрифуге при 10 000—12 000 об./мин 3—5 мин;
5) надосадочную жидкость удаляют, осадок дважды центрифугированием промывают дистиллированной водой;
6) к осадку добавляют 20 мкл деионизованной воды, прогревают 10 мин при 100 °С, центрифугируют при 12 000 об./мин 2 мин. Для ПЦР используют 1—3 мкл надосадочной жидкости.
Пищевые продукты гомогенизируют в ЗФР в соотношении 1 : 10, тщательно перемешивают в течение 15 мин, центрифугируют при 12 000 об./мин 10 мин, осадок суспендируют в 300—500 мкл дистиллированной воды и проводят дальнейшую обработку в соответствии с п. 2.
Постановку ПЦР осуществляют согласно наставлениям к наборам для ПЦР «Амплисенс® Yersinia pseudotuberculosis» и «Амплисенс® Yersinia enterocolitica»
Для учета результатов ПЦР проводят электрофорез в 1,5 % агарозном геле. После окрашивания этидий бромидом гель просматривают в трансиллюминаторе с длиной волны ультрафиолетового излучения 310 нм. Образовавшиеся в результате реакции амплифицированные фрагменты ДНК (полосы в геле, светящиесяся в УФ-лучах) идентифицируют по размеру, сравнивая с маркером молекулярного веса или положительным контролем.
|
|
|
Использование ПЦР дает возможность получить сигнальный результат в течение 1-х суток исследования, а наиболее короткий срок выделения культуры и идентификации иерсиний составляет 5—8 сут.
ПЦР-анализ можно использовать при 3-этапном варианте бактериологического исследования.
| 1 этап Подготовка проб: 1 г материала + 9 мл ЗФР (1 : 10). Суспендировать, грубые частицы осадить в центрифуге при 1 000 об./мин – 30 с |
 100 мкл
|
 подготовка проб для ПЦР
| Проведение ПЦР, электрофорез, получение результата через 4—6 ч после поступления материала |
2 этап
 (3-и сутки)
холодовое обогащение
|
 щелочная обработка
| 
| подготовка проб для ПЦР | 
| Проведение ПЦР, получение результата на 3-и сутки после поступления материала |
бактериологический
высев
3 этап
(5-е сутки). Учет результатов
бактериологического
исследования, выделение
и идентификация культур
Двукратно ПЦР – отрицательные анализы позволяют прекращать дальнейшее бактериологическое исследование.
Серологические методы
Общие правила постановки серологических реакций
Антитела к возбудителям псевдотуберкулеза и иерсиниоза появляются в крови уже на первой неделе болезни, а существенное повышение их уровней происходит к началу_3-й неделе. Этими сроками регламентировано обязательное исследование парных сывороток крови. Через 2 месяца часто наблюдается снижение концентрации антител, а через 6 месяцев они могут обнаруживаться в минимальных значениях (1 : 50; 1 : 100).
Наиболее выраженная динамика антителообразования наблюдается у больных с заболеванием средней тяжести. При легком течении, особенно при абдоминальной форме, динамика антител выражена слабо, титры антител начинают регистрироваться в диагностических значениях не ранее второй недели заболевания.
В связи с наличием у иерсиний перекрестно реагирующих антител учитываемый минимальный диагностический титр в РА и РНГА считается равным 1 : 160 и 1 : 200 соответственно. Достоверным считается 2—4-кратное и выше нарастание титра антител при исследовании парных сывороток.
Реакция агглютинации (РА)
Для постановки РА используют стандартные иерсиниозные антигены распространенных серотипов, представляющие собой 10-миллиардную взвесь иерсиний эталонных штаммов в S-форме, убитых формалином и суспендированных в 0,9 %-м растворе хлорида натрия. Перед постановкой антигены разводят 1 : 10 (рабочая концентрация 1 млрд). Реакцию ставят методом равных объемов. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)
Для постановки РНГА используют стандартные эритроцитарные диагностикумы к Y. pseudotuberculosis I серотипа и Y. enterocolitica серотипов О : 3 и О : 9, представляющие собой полисахаридные антигены иерсиний, фиксированные на поверхности формалинизированных бараньих эритроцитов.
В связи с тем, что срок годности эритроцитарных диагностикумов составляет 3 года, необходима периодическая (не реже 1 раза в квартал) проверка их активности. Ее проводят с контрольной псевдотуберкулезной сывороткой с известным титром иерсиниозных антител. Если диагностикум выявляет в сыворотке антитела в концентрации на 3 разведения ниже, чем они в ней содержатся, то такой препарат не пригоден для дальнейшего использования.
Методика постановки и учета РНГА приведена в инструкции по применению.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Для постановки ИФА используют тест-системы «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgM», «Иерсиниоз-ИФА-IgG», предназначенные для выявления антител классов A, M и G к возбудителям кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза. Высокая чувствительность и специфичность метода достигается благодаря использованию в качестве антигенов, сорбированных на поверхности стрипов, нескольких рекомбинантных белков наружной мембраны иерсиний. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.
Приложение 3
Среды, используемые для первичного выделения культур
Жидкие среды накопления:
Пептонно-калиевая среда (ПК * )
Состав среды: пептон ферментативный – 10,0 г
двузамещенный фосфорно-кислый калий (К2НРО4) – 1,0 г
Способ приготовления: компоненты вносят в 1,0 л дистиллированной воды, кипятят, помешивая, 2—3 мин, доводят рН до 7,6—7,8. Среду стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм. 20 мин. Хранят при 4—7 °С в течение 7—10 дней.
Среда для подавления роста посторонней микрофлоры
Готовят растворы: 40 % КОН (40 г КОН на 100 мл дистиллированной воды)
0,5 % NaCl (0,5 г NaCl на 100 мл дистиллированной воды)
Растворы стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм. 30 мин, хранят при 4—7 °С.
Рабочую концентрацию среды готовят, смешивая 10,0 мл 0,5 %-го раствора NaCl и 0,18 мл 40 %-го раствора KOH. Среда не подлежит хранению.
Плотные питательные среды:
Дифференциально-диагностическая среда для выделения иерсиний (СБТС * * ), рН 7,8
Состав среды: питательный агар для культивирования микроорганизмов – 35,0 г
желчь очищенная – 6,0 г
глюкоза – 10, 0 г
мочевина – 5,0 г
бромтимоловый синий воднорастворимый – 0,128 г
двузамещенный фосфорно-кислый калий (К2НРО4)
– 1,0 г
Способ приготовления: компоненты вносят в 1,0 л дистиллированной воды, нагревают до кипения и кипятят 5 мин на медленном огне. Затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр, вновь кипятят 1—2 мин, охлаждают до 45—50 °С и разливают в чашки Петри. Хранят среду в течение 7—10 дней при 4—7 °С.
Приложение 4
Среды, используемые для идентификации вирулентных иерсиний
Среда Кларка для определения аутоагглютинации
Состав среды: двузамещенный фосфорно-кислый калий (КН2РО4) – 5 г
пептон – 7 г
глюкоза – 5 г
вода – до 1 л
Способ приготовления: пептон и фосфат растворяют в воде и кипятят 2—5 мин. Затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют автоклавированием при 1 атм. в течение 20 мин, асептично добавляют стерильный раствор глюкозы и разливают по 3—5 мл в пробирки.
Среда для определения кальцийзависимости (кальцийдефицитный агар)
Готовят растворы: 0,25 М щавелево-кислого натрия (33,5 г на 1 л дистиллированной воды)
0,5 М хлорида магния (101,5 г на 1 л дистиллированной воды).
Растворы стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм. 30 мин, хранят при 4—7 °С.
В качестве питательной основы используют среду АГВ. В 100 мл расплавленной среды (около 50 °С) асептично вносят 8 мл 0,25 М раствора щавелево-кислого натрия, тщательно перемешивают; добавляют 4 мл 0,5 М раствора хлорида магния (указанная последовательность внесения солей обязательна). После перемешивания готовую среду разливают по 15—20 мл в чашки Петри. Хранят среду в течение 7—10 дней при 4—7 °С.
Нормативные и методические документы
1. Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ.
2. Постановление Правительства Российской федерации от 24 июня 2000 г. № 554 «Об утверждении положения о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации и Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании».
3. СП. 3.1.094—96, ВП 13.3.1318—96 «Иерсиниозы».
4. СП 1.3.2322—08 «Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
5. СП 3.5.3.1129—02 «Санитарно-эпидемиологические требования к проведению дератизации».
6. МУ 1.3.1888—04 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III и IV групп патогенности».
7. МУ 3.5.5.1034—01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I—IV групп патогенности при работе методом ПЦР».
* Состав среды защищен патентом.
** Состав среды защищен патентом. Аналог выпускает ГосНИИ прикладной микробиологии (пос. Оболенск, Московская обл.).
Дата добавления: 2019-11-16; просмотров: 109; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!