Выбор методов исследования на территории России (2007-2008гг.) описывают Куриннов В.В., и авторы (2009г.)
«…для установления окончательного диагноза выполняли методы прямого обнаружения вируса АЧС – реакция прямой иммунофлуоресценции и полимеразная цепная реакция с использованием диагностикумов собственного производства («Набор препаратов для дифференциальной иммунофлуоресцентной диагностики африканской чумы свиней, классической чумы свиней и болезни Ауески» и «Тест-система для выявления ДНК вируса АЧС методом полимеразной цепной реакции»).
В результате проверки проб органов от 83-х свиней, доставленных из очагов АЧС, диагностическая чувствительность ПЦР (по сравнению с РПИФ) составила 94%, диагностическая специфичность – 100%, а совпадение результатов РПИФ и ПЦР – 97,6 %. Метод обнаружения вируса по феномену гемадсорбции в инокулированной первичной культуре клеток лейкоцитов свиньи (или костного мозга) использовали для изоляции вируса и не всегда отрицательные результаты совпадали с РПИФ и ПЦР. Длительность получения результатов (в том числе и из-за необходимости выполнения пассажей) отрицательно сказывалась на получении окончательного результата и своевременном начале проведения мероприятий. Изоляция вируса биопробой на поросятах по времени была, в ряде случаев, даже короче (иногда аутогемадсорбцию обнаруживали на 4-5 сутки после введения материала).
Хорошие диагностические показатели прямых методов обнаружения вируса (точность, экспрессность), полученные при исследовании полевых проб, а также потенциальная потребность в наборах внутри страны стали основанием для увеличения их производства.
|
|
|
Основываясь на полученных данных диагностической оценки методов была выбрана схема обнаружения вируса (точнее, его компонентов) РПИФ и ПЦР. Первичные положительные результаты обоих методов (или одного из них) подтверждали биопробой на животных или изоляцией вируса с использованием первичной культуры клеток костного мозга свиней), во вторичных очагах – только РПИФ и ПЦР. В случае получения отрицательных результатов методов пробы проверяли на содержание вируса КЧС».
Способы лабораторной диагностики хорошо представлены источником http://sanidadanimal.info/cursos/asf-ruso/caps/cap8.html :
Прогресс в области диагностики, связан с развитием высоко чувствительных методов, позволяющих надежно диагностировать острую, хроническую и инапарантную форму АЧС в течение нескольких часов.
Существует множество методов обнаружения вируса и специфических антител. Наиболее часто используемыми в настоящее время методами диагностики АЧС являются: ПЦР (стандартная и в режиме реального времени) для обнаружения вируса; ИФА и имммуноблотинг для исследования сывороток. Дальнейшая схема показывает методы и их применение наиболее часто используемые в референтных лабораториях.
|
|
|
Рис.10.
- Реакция гемадсорбции.
Вирус АЧС выделяют с использованием первичной культуры клеток свиных макрофагов. В организме животного вирус инфицирует и реплицируется в лейкоцитах периферической крови, где вызывает развитие цитопатического эффекта в зараженных макрофагах. До наступления лизиса клеток вызванного вируса можно отметить феномен гемадсорбции. Микроскопические наблюдения показывают образование морул и розет из эритроцитов вокруг лейкоцитов.
Некоторые штаммы АЧС являются не гемадсорбирующими. В этих случаях, должны быть проведены дополнительные исследования осадка клеток методами ПЦР и РПИФ, чтобы подтвердить наличие вируса.
Реакция гемадсобции является наиболее специфичным и чувствительным методом идентификации, поскольку ни один из вирусов поражающих свиней не вызывает развитие феномена гемадсорбции. Она является референтной методикой несмотря на трудности в постановке и продолжительности выполнения (5-10 дней). Обычно используется только в референтных лабораториях.
- Реакция прямой иммунофлюоресценции (РПИФ)
|
|
|
РПИФ рекомендуется использовать при отсутствии возможности проведения ПЦР. Данный метод лучше использовать совместно с другими серологическими тестами (ИФА и иммуноблотинг), что бы исключить ложноотрицательные результаты, вызванные блокировкой антителами.
РПИФ основана на обнаружении вирусных антигенов в срезах тканей или мазках-отпечатках при взаимодействии с флюоресцентным конъюгатом. Это очень быстрый, простой и чувствительный метод, который также может быть использован при исследовании зараженных культур клеток. Микроскопические наблюдения показывают интенсивную флюоресценцию цитоплазматических включений в инфицированных клетках. При активном развитии инфекции флюоресценция может иметь зернистый вид.
В регионах где АЧС является эндемичной, и подострая и хронические формы болезни являются предоминантными, чувствительность данного метода уменьшается и составляет всего 40% при исследовании срезов органов и мазков-отпечатков.
Совместное использование РПИФ и РИФ или ИФА позволяет обнаруживать от 85% до 95% от всех случаев болезни (даже при наличии антител) менее чем за 1 час 15 минут. Не существует коммерческих наборов для данного метода.
|
|
|
Рис.11.
- ПЦР (полимеразная цепная реакция)
ПЦР (полимеразная цепная реакция) наиболее часто используемая техника для обнаружения вируса. Она требует профессиональных навыков и достаточного опыта для постановки реакции, чтобы исключить контаминацию образцов и ложноположительные результаты. ПЦР является очень чувствительной и специфичной техникой обнаружения вируса , путем амплификации вирусной ДНК из исследуемого образца. В настоящее время широко используется референтными лабораториям для диагностики и подтверждения АЧС. ПЦР используется при исследовании образцов тканей и сывороток от животных с клиническими признаками болезни. Вирус при помощи ПЦР удается обнаруживать в крови больных животных начиная со 2 дня после заражения и в течение нескольких недель.
Рис.12.
Рис.13.
Данный метод основан на применение праймеров комплементарных консервативному участку генома АЧС и позволяет обнаруживать широкий диапозон известных изолятов вируса АЧС, включая как гемадсорбирующие так и не гемадсорбирующие штаммы.
ПЦР может быть использована для исследования образцов плохого качества и малопригодных для исследований другими методами. При помощи ПЦР результаты могут быть получены в течение 5-6 часов.
Существует два различных метода ПЦР-диагностики вируса АЧС. Для обоих из них необходимым является этап пробоподготовки и выделения ДНК перед непосредственным проведением ПЦР:
Стандартная ПЦР: продукты реакции, полученные в результате амплификации вирусной ДНК, анализируются при помощи электрофореза в агарозном геле и УФ света.
ПЦР в режиме реального времени: Для данного метода необходимо использование специального оборудования для детекции флюоресцентного сигнала. ПЦР в режиме реального времени имеет несколько преимуществ: анализ результатов в ходе реакции (реальном времени), возможность количественного определения вирусной ДНК, не требует постановки электрофореза.
Дальнейшее секвенирование ПЦР продуктов позволяет подтвердить положительные результаты реакции, и также определить генотип вируса при амплификации некотрых фрагментов генома вируса (ген p72, ген p54, центральный вариабельный регион -CVR).
Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 172; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!