Методика определения активности супероксиддисмутазы (СОД)
МИНОБРНАУКИ РОССИИ
Федеральное государственное автономное образовательное
Учреждение высшего образования
«ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Академия биологии и биотехнологии им. Д.И. Ивановского
ОТЧЕТ
О прохождении учебной практики
Место прохождения практики – кафедра экологии и природопользования
Вид практики учебная ________________________________________________________
Тип практики практика в целях получения первичных профессиональных умений инавыков _____________________________________________________________________
Способ проведения практики __непрерывная______________________________________
Форма проведения практики__стационарная _____________________________________
Обучающийся Зеленская Ирина Павловна очной формы обучения
Направление 06.03.01 – Биология, бакалавриат / _________________ /
подпись
Руководитель практики от ЮФУ:
Ассистент каф. биохимии и микробиологии. Плотников А. А
Ростов-на-Дону
2019 г.
Введение
Одним из основных навыков для биологов являются навыки прикладной работы в лабораториях. Для будущих специалистов крайне важно обучится проводить необходимые анализы и исследования, для которых необходимо усвоить правила работы в лаборатории, приобрести навык работы с лабораторным оборудованием, таким как микроскопы, весы ( как электронные, так и механические), спиртовки, плитка, центрифуги, обучиться работе с реагентами и с посудой, изучить методы обработки и подготовки проб и материалов для исследования. Также важно усвоить методы исследований, выработанных и совершенствуемых на протяжении многих лет учёными-специалистами, и научиться обработке, трактовке и анализу результатов. Все эти знания и навыки необходимы и для дальнейшего обучения и для будущей работы, как в исследовательской сфере, так и в сфере всевозможных лабораторных анализов. Для приобретения вышеперечисленных навыков нами был пройден большой практикум.
|
|
|
Пояснительная записка
Целью большого практикума являлось освоение биохимических методов на биологическом материале млекопитающих (крови и плазме).
Для достижения цели проекта, были поставлены следующие задачи:
1. Изучить известные данные о биохимических методиках исследования крови и плазмы, использованных в данной работе.
2. Отработать методики проведения биохимического анализа биоматериалов.
Методика проведения исследований
Метод определения малонового диальдегида (МДА) с помощью тиобарбитутовой кислоты
| Источник | Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитутовой кислоты // Современные методы в биохимии/ под ред. Ореховича В.Н. - М.: Медицина, 1977.- С. 66-68. |
| Принцип метода | При высокой температуре в кислой среде малоновый диальдегид реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой, образуя окрашенный триметиновый комплекс с максимумом поглощения при 532 нм. Триметиновый комплекс состоит из одной молекулы МДА и двух молекул 2-тиобарбитурата и обладает розовой окраской. Молярный коэффициент экстинкции этого комплекса ε0=1,56*105 [M-1•см-1] (Hunter e.a., 1963) |
| Биоматериал | 1% гемолизат, плазмы/сыворотка крови, гомогенаты тканей |
| Реактивы | 30% трихлоруксусная кислота ТХУ 0,75% 2-тиобарбитуровая кислота ТБК 0,05 н NaOH |
| Оборудование | Водяная баня (100°С), центрифуга, центрифужные пробирки, дозатор на 100-1000 мкл, СФ, таймер |
| Ход работы | 1 мл биосубстрата S (0,2 мл плазмы) + 1 мл 30% ТХУ + 1 мл 0,75% ТБК. Кипящая водяная баня (+1000С) 20 минут (закрыть пробирку пробкой с обратным холодильником). Затем охладить и центрифугировать 10 минут при 3000 об/мин. Определить оптическую плотность супернатанта на ФЭК l=540 нм или СФ l=532 нм в кюветах с длиной оптического пути 1см против холостой пробы или dH2O Холостая проба: вместо биоS взять dH2O, обработать так же. |
| Расчет | 
Еоп – экстинкция опытной пробы (безразмерная)
Ехол – экстинкция холостой пробы (безразмерная)
Vпробы – объем всей пробы (л)
VбиоS – объем биоматериала (л)
Vпробы/ VбиоS – разведение биоматериала
ε0=1,56*105 [M-1•см-1] – коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса
l – длина оптического пути (см)
Cpr – концентрация белка/гемоглобина (г/л)
Концентрация МДА выражается в нмоль/мг белка, гемоглобина или мл плазмы
|
| Приготовление реактивов | 1. 30% водный раствор ТХУ: 30г сухой ТХУ + 70г dH2O 2. 0,75% 2-ТБК: 0,75г 2-ТБК растворить в 100мл 0,05н NaOH 3. 0,05н NaOH: 0,2г NaOH растворить в 100 мл dH2O |
| Примечания | Перед добавлением ТБК время инкубации реактивов не имеет большого значения, после добавления ТБК ставить раствор на баню обязательно сразу и снимать через 20 мин. |
Методика определения активности супероксиддисмутазы (СОД)
|
|
|
|
|
|
| Источник | Сирота Т. В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использования его для измерения активности супероксиддисмутазы.// Вопросы медицинской химии. – 1999. - №3. | ||||||||||||||
| Принцип метода | основан на способности СОД ингибировать процесс восстановления нитротетразолия синего (НТС) при аутоокислении адреналина в адренохром в щелочной среде в условиях генерации супероксидного анион-радикала. | ||||||||||||||
| Биоматериал | Гемолизат – осадить гемоглобин (1мл 1% гемолизата + 0,4мл ледяной смеси этанол:хлороформ → вортекс 45сек →центрифуга 3 тыс.об.мин. 10 минут) Анализировать супернатант. | ||||||||||||||
| Реактивы | Этиловый спирт (96%), хлороформ (очищенный) Смесь этанол:хлороформ для осаждения гемоглобина 50 мМ Na-карбонатный буфер рН 10,2 6,11 мМ НСТ (1мг:1мл растворителя) адреналин (0,1% аптечный) 3% HCl | ||||||||||||||
| Оборудование | Водяная баня (37°С), пробирки, дозаторы на 20 мкл, 100-150мкл, 1мл, 5мл, секундомер | ||||||||||||||
| Ход работы |
* на серию опыта можно заложить контроль не на каждую пробу, а 2-3 на серию.
 Мы поможем в написании ваших работ! |