Действия перед началом процедуры
5.1.1. Включить в микробиологическом боксе УФ-облучатель на 15-20 мин.
5.1.2. Выключить УФ-облучатель, включить приточную, а затем вытяжную вентиляцию.
5.1.3. Протереть рабочий стол спиртом этиловым 70%.
5.1.4. Приготовить на рабочем столе необходимые для анализа питательные среды и посуду, промаркировать колбы, пробирки, чашки Петри.
5.1.5. Разогреть на электрической плитке необходимые агаризованные среды..
Количественное определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов
5.2.1. Приготовить навеску исследуемого образца в соответствии с ГОСТ ....
5.2.2. Взвесить в стерильную колбу 10 г (мл) исследуемого образца (твердый образец растереть в стерильной ступке до порошка), добавить в колбу 100 мл стерильного фосфатно-буферного раствора. В случае жидкого исследуемого образца внести в колбу пипеткой 10 мл образца и добавить 90 мл фосфатно-буферного раствора. Полученное разведение образца считать 1:10. Аналогично сделать разведения 1:100 и, при необходимости, 1:1000.
5.2.3. Отобрать из пробирки с наибольшим разведением 2 мл исследуемого образца и внести по 1 мл в каждую из двух чашек Петри. Добавить в чашки по 20-25 мл расплавленного и охлажденного до 40ºС МПА и быстро перемешать, вращая чашку круговыми движениями, не отрывая от стола. Аналогично провести посев образца из меньших разведений.
5.2.4. После застывания агара убрать чашки с МПА для инкубирования в термостат на 32,5±2,5 ºС.
|
|
|
5.2.5. Посевы инкубировать в течение 72±3 часа в аэробных условиях, просматривая их ежедневно.
5.2.6. По окончании инкубации подсчитать количество колоний, выросших на чашках. для подсчета отобрать чашки, на которых выросло от 15 до 300 колоний. Определить среднее количество колоний на двух чашках и пересчитать на 1 г (мл) исследуемого образца.
5.2.7. При необходимости сделать мазки, окрасить их по Граму и микроскопировать.
5.2.8. Промежуточный и конечный результат заносить в журнал микробиологического контроля.
5.2.9. По окончании работ провести обеззараживание (дезинфекцию) лабораторной посуды, используемой при проведении испытания, и утилизацию образовавшихся отходов.
Выявление БГКП
5.3.1. Для выявления БГКП использовать среду Кесслера в пробирках или колбах. Отобрать из пробирки с разведением препарата 1:10 исследуемый образец и внести его в пробирку или колбу со средой Кесслера. Соотношение между количеством высеваемого образца и питательной средой должно быть 1:9.
5.3.2. Посевы инкубировать при 36±1оС в течение 24-48 часов.
- При помутнении среды, изменении цвета среды, образовании газа считать, что исследуемый образец контаминирован БГКП.
5.3.3. Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на среде Кесслера, к БГКП сделать пересев бактериологической петлей со среды Кесслера на чашку со средой Эндо с последующим микроскопированием мазка, окрашенного его по Граму.
|
|
|
- Если на среде Эндо обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, растущие в виде колоний бледно-розового или малинового цвета с металлическим блеском или без него, то считать, что исследуемый образец контаминанирован БГКП.
Количественное определение БГКП
5.4.1. Для количественного определения БГКП использовать навеску образца, приготовленного по п.п 5.2.1., 5.2.2.
5.4.2. Отобрать из пробирки с наибольшим разведением 2 мл исследуемого образца и внести по 1 мл в каждую из двух чашек Петри. Добавить в чашки по 20-25 мл расплавленной и охлажденной до 40ºС среды Эндо и быстро перемешать, вращая чашку круговыми движениями, не отрывая от стола. Аналогично провести посев образца из меньших разведений.
5.4.3. Посевы инкубировать при 36±1оС в течение 24-48 часов, просматривая их ежедневно.
5.4.4. По окончании инкубации подсчитать количество колоний, выросших на чашках. Для подсчета отобрать чашки, на которых выросло от 15 до 300 колоний. Определить среднее количество колоний на двух чашках и пересчитать на 1 г (мл) исследуемого образца.
|
|
|
5.4.5. При необходимости сделать мазки, окрасить их по Граму и микроскопировать.
5.4.6. Промежуточный и конечный результат заносить в журнал микробиологического контроля.
Выявление Staphylococcus aureus .
5.5.1. Навеску исследуемого образца внести в среду обогащения (солевой бульон) в соотношении 1:10, при использовании среды двойной концентрации 1:1. При испытании высококислотных продуктов для предотвращения резкого снижения рН (на 0,5 и более) питательных сред после внесения в них продукта довести до допустимых значений с помощью стерильного раствора гидроокиси натрия. Допускается доводить рН до нейтрального значения с помощью стерильного раствора гидроокиси натрия в самом высококислотном продукте. Посевы инкубировать при 37±1°С в течение 24-48 ч.
5.5.2. При наличии роста через 24 часа или через 48 часов (даже при отсутствии признаков роста) сделать высев на поверхность чашки Петри с желточно-молочно солевогым агарои. Чашки Петри с посевами инкубировать при 37±1°С в течение 24-48 ч.
5.5.3. Выросшие колонии окрасить по Грамму и микроскопировать мазки. На желточно-молочно солевом агаре колонии коагулазоположительных стафилококков круглые, слегка возвышающиеся над поверхностью агара, с ровными краями, диаметром 2,0-2,5 мм, окрашены в желтый, золотистый, кремовый, палевый или белый цвет и окружены зоной лицетиназной активности. Если в мазках обнаружены грамположительные кокки, расположенные скоплениями, напоминающими гроздья винограда, продолжить испытание на наличие фермента коагулазы.
|
|
|
5.5.4. Для этого сделать пересев пяти подозрительных на принадлежность к S. aureus колоний в пробирку со скошенной средой № 1, инкубировать при 32,5±2,5°С в течение 24 ч.
5.5.5. Развести сухую цитратную кроличью плазму в 5 мл стерильного физраствора и разлить по 0,5 мл в 3 стерильные пробирки.
5.5.6. В одну пробирку добавить петлей суточную культуру выделенных кокков на среде № 1. Во вторую пробирку музейную культуру S. aureus (положительный контроль). Третью пробирку оставить с плазмой (контроль неконтаминированной плазмы). Пробирки инкубировать при 32,5±2,5°С в течение 4-6 ч., просматривая реакцию через каждый час. При отсутствии положительной реакции плазмокоагуляции - плотного геля в пробирке, удлиняют время инкубации до 24 ч.
5.5.7. Если в образце обнаружены грамположительные кокки, обладающие коагулазой и образующие каталазу, считать, что в исследуемом присутствуют коагулазоположительные стафилококки.
5.5.8. Для подтверждения принадлежности выявленных коагулазоположительных стафилококков к S.aureus провести определение ацетоина и ферментации мальтозы в анаэробных условиях.
5.5.9. Определение ацетоина проводить путем высева культуры в среду Кларка. Посевы инкубировать при 37±1°С в течение 24-48 ч. К 1 мл посевной жидкости доббавить 0,6 мл альфа-нафтола и 0.2 мл раствора гидроокиси калия. Пробирку встряхнуть. Появление розового окрашивания указывает на положительную реакцию. S.aureus образует ацетоин.
5.5.9. Определение ферментации мальтозы в анаэробных условиях проводить, высевая культуру уколом петлей в пробирку со средой Гиса с мальтозой. Посевы инкубировать при 37±1°С в течение 24-48 ч. S.aureus ферментирует мальтозу в анаэробных условиях. Цвет среды Гиса изменяется.
5.5.10. Если коагулазоположительные стафилококки образуют ацетоин и сбраживают мальтозу в анаэробных условиях, считать, что исследуемый образец контаминирован S.aureus.
Определение Escerichia coli
5.6.1. Посевы для определения количества E.coli в 1 г (мл) продукта и выявления E.coli в определенной навеске продукта проводят по ГОСТ 30518.
5.6.2. Посевы на жидкой среде Кесслер и агаризованной среде Эндо инкубируют при температуре (36±1)о С в течение 24-48 ч. Чашки Петри инкубируют дном вверх. Псевы просматривают через 24±3 ч, отмечают положительные посевы в жидких средах, а окончательный учет проводят 48±3 ч.
5.6.3. Положительными считают посевы в жидкие среды (Кесслер), в которых имеет место рост микроорганизмов, проявляющийся помутнением среды, образованием газа. Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших в жидких средах, к E.coli делают пересевы по ГОСТ 26670 на поверхность среды Эндо.
5.6.4. Посевы инкубируют при температуре (36±1)о С в течение 24±3 ч.
5.6.5. Посевы на агаризованной среде Эндо просматривают после инкубирования и отмечают рост характерных для E.coli колоний. На среде Эндо E.coli образует колонии от бледно-розового до темно-красного цвета часто с металлическим блеском.
5.6.6. Для дальнейшего подтверждения выросших колоний к E.coli отбирают по три колонии каждого типа. Из отбранных колоний приготавливают мазки, окрашивают их по Грамму.
5.6.7. Параллельно в каждой отобранной колонии у бактерий определяют отсутствие оксидазы. Оксидазоотрицательные бактерии пересевают на поверхность ГРМ-агара. Посевы инкубируют до появления видимого рост при температуре (36±1)о С.
5.6.8. У оксидазоотрицательных грамотрицательных культур (палочки размером 1,1-1,5х2-6мкм) выросших в пересевах определяют возможность образования индола, ацетоина (реакция фогес-Проскауэра), сероводорода, утилизации цитрата, интенсивность ферментации углеводов с образованием кислоты, ферментацию собита, глюкозы и лактозы. Биохимическое тестирование проводят с использованием среды Клиглера и тест-системы «СИБ для идентификации энтеробактерий». Определяют также ферментацию лактозы при температуре (44±1)о С.
Основные дифференцирующие признаки E.coli:
Образование индола (+)
Реакция с метил-рот (+)
Реакция Фогес-Проскауэра (-)
Утилизация цитрата (-)
Образование сероводорода (-)
Ферментация целлобиозы (-)
Ферментация глюкозы с образованием кислоты (+)
Ферментация глюкозы с образованием газа (+)
Ферментация лактозы (+)
Ферментация сорбита (+)
Образование оксидазы (-)
5.6.9. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
К бактериям E.coli относят оксидазоотрицательные не образующие спор грамотрицательные палочки, обладающие способностью ферметации лактозы при температуре (44±1)о С, ферментирующие глюкозу и сорбит, дающие положительную реакцию с метил-рот, образующие индол, не образующие ацетоин и не утилизирующие цитрат. Бактерии, не ферментирующие сорбит и целлобиозу, но по другим биохимическим признакам давшие типичные для E.coli реакции, относят к сорбитотрицательным штаммам E.coli.
НВЧ E.coli в 1 г (мл) продукта определяют по количеству положительных проб (пробирок) по ГОСТ 26670.
Дата добавления: 2019-07-15; просмотров: 136; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!