Этапы занятия и контроль их усвоения
| N | Этапы проведения занятия | Форма проведения | Вре-мя (мин) |
| 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6. | Постановка задачи. Контроль исходного уровня знаний. Разбор теоретического материала. Разбор метода электрофореза, разделения белков сыворотки крови на ацетатцеллюлозных мембранах, демонст- рация приборов для электрофореза на бумаге, в полиакриламидном геле и на АЦМ. Приобретение практических навыков Проведение лабораторной работы по диализу, разделению белков фракционным высаливанием и реакциям обратимого и необратимого осаждения. Оформление протоколов. Подведение итогов занятия | Излагает препо-даватель. Тестовый контроль. Опрос студентов. Излагает преподаватель. Индивидуаль-ная лабораторная работа. Обсуждение выполненной работы. | 5 15 50 30 60 20 |
Пример тестового контроля.
1.Выберите правильные ответы: вид осаждения из раствора и конкретный механизм осаждающего фактора, если осаждающим фактором является перекись водорода.
Вид осаждения:
1 обратимое
2 необратимое
Механизм действия осаждающего фактора:
а) изменение гидратации молекул белка;
б) изменение ионизации групп ( NН2, COOH) при сдвигах рН среды;
в) связывание функциональных групп белка (NH2,NH,OH,SH);
г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S-связей;
|
|
|
д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов поли
пептидной цепи, разрыв гидрофобных, водородных связей в молекуле белка.
2. Какова растворимость основных белков в слабокислой среде?
Напишите схему ионизации, укажите суммарный заряд молекулы.
Практическое применение осадочных реакций
| Характер Осаждения | Факторы | Применение в гигиенической и лечебной практике |
| Денатура ция | Температура 70-80 град. | Пастеризация пищевых продуктов, бактериологических питательных сред, лекарственных препаратов. |
| Температура 100 град. | Кулинария, термическая обработка воды и пищи. Дезинфекция и дезинсекция одежды и белья. | |
| Соли тяжелых металлов (Hg, Ag, Cd, Pb, Cu) | Дератизация. Удаление доброкачественных кожных новообразований | |
| Окислители (например Н2О2 KMnO4, спиртовый раствор йода) | Антисептика, обработка инструментов и кожи | |
| Сильные минеральные и органические кислоты | Осаждение белка из биологических жидкостей при биохимических анализах. Качественные пробы на белок и количественное определение белка ( в моче) | |
| УФ-радиация | Дезинфекция воздуха в операционных и палатах | |
| Высали вание | Соли аммония и щелочных металлов | Приготовление кристаллических белковых препаратов. Разделение белковых фракций. |
|
|
|
Лабораторная работа № 3
Обратимое и необратимое осаждение белка. Фракционное разделение белков. Диализ. Электрофорез.
Реактивы и оборудование
1. Штативы для пробирок. 2. Водяная баня.3. Диализатор стеклянный с целлофановой мембраной. 4. Химические пробирки.5. Стеклянные воронки. 6. Раствор яичного белка.7.Раствор сульфата меди-II- 5%. 8. Раствор гидроксида натрия – 10%. 9. Раствор ацетата свинца-II – 5%. 10. Раствор сульфосалициловой кислоты - 20%. 11. Азотная кислота концентрированная. 12. Раствор сульфата аммония -5 0% 13. Сульфат аммония кристаллический. 14. Раствор нитрата серебра 1%.
Обратимое и необратимое осаждение белков (высаливание и денатурация)
Ход работы : берут штатив с 5 пробирками и в каждую отмеривают по 5 капель раствора яичного белка. Первую пробирку помещают на 2-3 мин. в кипящую водяную баню. Во вторую пробирку добавляют по каплям (5-6 капель) соль тяжелого металла (ацетата свинца). В третью пробирку раствор азотной кислоты. В четвертую – раствор сульфасалициловой кислоты. В пятую пробирку – раствор сульфата аммония. Наблюдают появление осадков во всех пробирках. Затем во все пробирки добавляют дистиллированную воду, в объеме, равном содержимому пробирок, встряхивают и наблюдают растворились ли осадки и делают выводы о типе осаждения белка в каждой пробирке ( денатурации или высаливании). Резу4льтаты работы оформляют в виде таблицы.
|
|
|
| № пробирки | Осаждающий фактор | Результат появление или отсутствие осадка | Растворим осадок или нет | Вывод указать характер осаждения |
| 1 | ||||
| 2 | ||||
| 3 | ||||
| 4 | ||||
| 5 |
II.Диализ
Ход работы: в 2 пробирки наливают раствор яичного белка, содержащего примесь хлорида натрия; в одной делают биуретовую реакцию, в другой реакцию на ионы хлора с нитратом серебра в присутствии азотной кислоты – 5к. белка + 3 к. AgNO3 . в двух других пробирках делают те же реакции с дистиллированной водой. Раствор яичного белка наливают в диализатор, который погружают в стакан с дистиллированной водой. Через 1 час вынимают диализатор из стакана и вновь, с небольшими порциями воды (диализата) и раствора яичного белка (диализируемой жидкости), проделывают биуретовую реакцию и реакцию на ионы хлора.
|
|
|
| Название реакции | Диализируемая жидкость (солевой раствор белка – содержимое внутреннего такана) | Диализат (содержимое наружного стакана)
| ||
| до опыта | после опыта | до опыта | до опыта | |
| 1. биуретовая 2. на ионы хлора | ||||
Вывод
Методы разделения белков.
1) Высаливание нейтральными солями
2) Хроматография
3) Гель-фильтрация
4) Ультрацетрифугирование
5) Изоэлектрофокусирование
6) Температурная денатурация
7) Иммунологические методы
8) Электрофорез
III. Фракционное высаливание белков. Разделение альбуминов и глобулинов
Ход работы: к 1 мл раствора белка добавляют равный объем (1 мл) насыщенного (50%) раствора сульфата аммония, хорошо перемешивают и оставляют на 10 мин для более полного осаждения белка. Через 10 минут образовавшийся осадок отфильтровывают через складчатый фильтр. В фильтрат добавляют крупинки кристаллического сульфата аммония до появления осадка (образуется 100% р-р сульфата аммония).
Результаты
| № пробирки | Субстрат | Степень насыщения раствора сульфата аммония | Результат | Какой белок выпадает в осадок |
| 1. 2. |
Вывод:
IY.Электрофорез
В плазме крови человека содержится 65-85 г/л белка, представленного различными про своему происхождению и свойствам фракциями. При различных острых и хронических заболеваниях, а также в результате действия многих повреждающих факторов внешней среды, таких как тяжелые металлы, окислители, органические растворители, хлорпроизводные, фосфорорганические соединения, вибрация, ультразвук и т.д. происходит изменение содержания в крови не только общего белка, но и белковых фракций (диспротеинемия). Выявление таких изменений имеет существенное клинико-диагностическое значение.
В разделении белковых фракций сыворотки крови основное значение принадлежит электрофорезу. Принцип этого метода основан на способности заряженных частиц (в том числе белков) перемещаться под действием электрического поля в зависимости от знака их заряда.
Скорость движения частиц в электрическом поле зависит от:
1. величины суммарного заряда частиц
2. размера и формы частиц
3. силы электрического тока и напряжения
4. свойств носителя, на котором проводят разделение
5. рН буферного раствора
6. температуры.
Виды электрофореза:
1. По направлению движения частиц основными являются два вида электрофореза горизонтальный и вертикальный.
2. По приборному оформлению:
- на пластинках;
- в трубочках
- в колонках
- капиллярный
3. По используемому носителю:
- на бумаге;
- на ацетатцеллюлозных мембранах;
- в геле (крахмальном, агарозном, полиакриламидном);
- без поддерживающей среды.
4. По интенсивности электрического поля:
- низковольтный (при используемом напряжении < 500 В)
- высоковольтный (при напряжении > 500 В)
Техника электрофореза впервые была предложена Тизелиусом в 1937 году.
Для проведения электрофореза требуются: источник постоянного тока и камера, заполненная буфером. Камера состоит из двух сообщающихся отделений: в одном находится электрод, в другом – конец поддерживающей среды, на которую наносится исследуемый материал (сыворотка крови).
Выбор буферного раствора определяется характером заряда исследуемых веществ. Для разделения сывороточных белков используют буферы с рН=8,6 (например, мединал-вероналовый). При такой величине рН молекулы белка заряжены отрицательно и их движение направлено к аноду.
В качестве поддерживающей среды для электрофореза используются:
1. Фильтровальная бумага: разделение проводится при низком напряжении поля, поэтому длится 16-18 часов, границы между отдельными фракциями получаются нечеткими, можно получить 5 основных белковых фракций сыворотки крови.
2. Пленки из ацетатцеллюлозы: дорогостоящие, разделение занимает меньше времени (30-40 минут), более эффективно. Получают также 5 фракций.Широко применяется для разделения и идентификации липопротеинов, изоферментов, гемоглобинов и для разделения белков мочи
3.Агар или агарозный гель представляют собой гетерополисахариды, менее дорогостоящие, чем ацетатцеллюлозные пленки, по эффективности не уступают им, разделение занимает около 90 минут; используются также при иммуноэлектрофорезе.
4. Крахмальный гель: обладает всеми преимуществами других гелей, характерен эффект молекулярного сита; используется, в основном , для предварительного разделения смеси белков.
5. Полиакриламидный гель: наиболее широко применяется; обладает высоким эффектом молекулярного сита; высокая эффективность разделения; можно получить до 20 белковых фракций сыворотки крови и более.
Этапы электрофореза:
1. Смоченную в буфере поддерживающую среду (носитель) помещают в камеру, заполненную буфером, и наносят на нее исследуемые пробы.
2. Подключают электроды и пропускают электрический ток и в течение определенного времени (зависит от поддерживающей среды) проводят разделение.
3. Фиксация проб с помощью ацетона, метанола или высокой температуры.
4. Окрашивание проб с помощью красителей (амидо черный, бромфеноловый синий, пунцовый S).
5. Удаление избытка красителя. Промывка электрофореграмм.
6.Определение процентного содержания фракций белка
- Сканирование электрофореграмм с помощью денситометра. В денситометре свет проходит через гель, поглощение света прямопропор-ционально количеству белка.
- Еще одним методом является элюирование окраски из основы с последующим колориметрическим измерением поглощения растворов. Но этот метод более трудоемкий и менее точный, и в настоящее время не используется в клинической практике.
7. Оценка полученных результатов.
В сыворотке крови человека в норме содержится альбумины – 55-65%; глобулины a1-2-5%; глобулины a2 –6-11%; глобулины b -11-15%; глобули-
ны g - 15-22%.
Осадочные пробы на белок
Поскольку количественное исследование фракционного состава белков плазмы трудоемко и нуждается в сложной аппаратуре, его часто заменяют качественными диспротеинемическими тестами. Они основаны на разной чувствительности отдельных белков плазмы крови к действию осаждающих агентов.Такие тесты позволяют оценить тяжесть патологического состояния и эффективность лечения, проследить динамику заболевания.
Установлено, что положительный результат коллоидно-химических проб чаще вызывается количественными изменениями в глобулиновых фракциях или изменением соотношения альбумины/ глобулины, т.е. он связан с увеличением содержания глобулинов либо уменьшением уровня альбуминов.
К коагуляционным тестам относятся реакции с сульфатом кадмия и цинка, тимоловая проба, реакция Гросса с хлоридом ртути (сулемовая проба), реакция Вельтмана с хлоридом кальция.
Наиболее часто используется тимоловая проба. Она основана на определении степени помутнения с помощью ФЭКа при взаимодействии сыворотки с насыщенным раствором тимола в вероналовом буфере. Причиной помутнения является взаимодействие молекул тимола и некоторых крупнодисперстных белков: g-глобулинов и b - липопротеинов. Эта реакция связана с образованием глобулино-тимол-липидного комплекса. Норма: 0-4 ед. помутнения.
Тимоловая проба положительна в 90-100% случает болезни Боткина, токсического гепатита, а также у больных с постгепатитным и постнекротическим циррозом, коллагеновыми заболеваниями, малярией и вирусными инфекциями. При механической желтухе проба в 75% случаев отрицательна. Она становится положительной лишь в том случае, если процесс осложняется паренхиматозным гепатитом.
Тестовый контроль по теме
Дата добавления: 2019-02-13; просмотров: 85; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!