Избирательное ацилирование аминов L -аминокислотами под действием ферментов папаина, бромелина или фицина.

 

Обрзующийся анилид L-аминокислоты нерастворим в воде и может быть легко отделен от D-изомера, а затем подвергнут гидролизу.

2. Асимметричный гидролиз. В этом случае осуществляется стереоспецифический гидролиз производных аминокислот, в результате которого образуется только один энантиомер. Эфиры L-аминокислот гидролизуют протеолитическими ферментами (химотрипсином); нужный продукт и не вступающие в реакцию D-эфиры разделяют по растворимости.

 

 

 

3. Использование амидаз. Эти ферменты из почек и поджелудочной железы млекопитающих или из микроорганизмов стереоспецифически гидролизуют амиды L-аминокислот. Образующуюся L-кислоту и непрореагировавший D- изомер затем разделяются методом дифференциальной растворимости. Амиды менее склонны к самопроизвольному гидролизу, чем эфиры, поэтому получаются более чистые препараты аминокислот.

Стереоспецифический гидролиз N -ацил - L -аминокислот под действием аминоацилазы или карбоксипепсидазы, приводящий к образованию L -аминокислот.

 

Принципы избирательного гидролиза аксиально или экваториально расположенной простой эфирной группы под действием ферментов лежит и в основе разделения рацемических смесей эфиров и терпенов.

     Весьма перспективным представляется использование ферментов в качестве датчиков  вредных и ядовитых веществ. Так, в качестве индикатора на фосфорорганические отравляющие вещества нервно-паралитического действия применяется холинэстераза. Ее так же возможно использовать и для определения многих пестицидов. Степень ингибирования этого фермента в присутствии ОВ или пестицидов оценивают электрохимическими или колориметрическими методами.

     Аналогично карбонгидраза весьма чувствительна к хлорпроизводным алифатических, а гексокиназа – ароматических углеводородов.

Все большее развитие получают технологические процессы с участием сложных энзиматических систем, включающих коферменты. Так, созданы ферментные мембранные реакторы, катализирующие непрерывные процессы с регенерацией НАДН (восстановительное аминирование кетокислот, восстановление α - кетокислот в α - гидроксикислоты). Разработаны системы разделения рацематов посредством стереоспецифического активного транспорта. Например, мембрана, содержащая гексокиназу и фосфатазу, функционирует как насос, избирательно прокачивающий лишь D-глюкозу. Применение сопряженных ферментативных реакций с участием алкогольоксидазы, каталазы дрожжей Hansenulla polimorphaи формальдегиддисмутазы бактерии Pseudomonas putidaпозволило осуществить окисление метанола в муравьиную кислоту с выхо­дом 88- 94%. В промышленности большое будущее имеют ферменты, способные катализировать химические реакции в органической фазе (“каталитические антитела”), в частности липазы. Существенно, что каталитическая активность панкреатической липазы свиньи сохраняется при концентрации воды в реакционной среде, составляющей всего 0,015 %, и при температуре 100 °С. Препараты липазы используют для синтеза оптически чистых сложных эфиров и феромонов, применяющихся в парфюмерии и медицине.

Для деградации и модификации антропогенных органических соединений, поступающих в окружающую среду, используют ферменты разных классов и в том числе лакказу, лигниназу, тирозиназу, монооксигеназу, диоксигеназу и др. Перспективна для очи­стки сточных вод новая технология, основанная на использовании реакции пластеинообразования, открытой А. Я. Данилевским в 1886 году. Сущность работ Данилевского состоит в экспериментальном доказательстве обращения протеолиза и возможности синтеза белковоподобных веществ (пластеинов) под действием ряда протеолитических ферментов. Сточные воды содержат аминокислоты и пептиды, концентрация которых возрастает в результате гидролиза белковых компонентов отходов под воздействием пептидогидролаз микроорганизмов. Данная технология, активно внедряющаяся во

Франции, нацелена на производство в промышленных масштабах кормовых белков из аминокислот и пептидов сточных вод.

     Развитие клеточной и генной инженерии было бы невозможно, если бы в распоряжении исследователей не было целого набора специфических ферментов (рестриктаз, лигаз, синтетаз, ферментов избирательно разрушающих клеточную оболочку и др.). Так, в настоящее время в продаже имеется более 300 различных рестриктаз.

Ферменты широко используют в медицине, например в заместительной терапии в составе лечебных препаратов. Пероральное введение фенилаланин-аммиак-лиазы снижает уровень фенилаланина в крови при фенилкетонурии. Протеолитические ферменты, амилазу и липазу применяют при заболеваниях желудочно-кишечного тракта и печени. В последние годы накопились данные об эффективности применения протеиназ в энзимотерапии злокачественных новообразований. Это объясняется большей проницаемостью мембран раковых клеток для гидролитических ферментов в сравнении с нормальными клетками, благодаря чему опухолевые клетки быстро лизируются при введении смеси протеиназ (препарат «папайотин»). Протеолитические ферменты - плазмин иактивирующие его стрептокиназу и урокиназу используют для растворения тромбов в кровеносных сосудах и разжижении гноя; коллагеназу - для рассасывания рубцовых образований; эластазу - для задержки развития атеросклероза; лизоцим - для лечения конъюнктивитов; дезоксирибонуклеазу из стрептококка (стрептодорназа) - для лечения заболеваний верхних дыхательных путей и роговицы глаза.

L -аспарагиназупродуцируют Е. coli и Erwinia carotovora. Фермент используют при химиотерапии некоторых форм лейкемии. L-аспарагиназа отщепляет одну аминогруппу от аспарагина, превращая его в аспарагиновую кислоту. Избирательность действия фермента определяется потребностью некоторых форм опухолевых клеток в аспарагине, тогда как нормальные клетки в аспарагине не нуждаются.

Нейраминидазу получают при культивировании Vibrio cholera. Фермент отщепляет остатки N-ацетилнейраминовой кислоты, входящей в мембрану некоторых опухолевых клеток, повышая таким образом их антигенную активность. Может быть использован при лечении некоторых форм лейкемии.

β-лактамазы, инактивирующие пенициллины и цефалоспорины, ис­пользуются при определении стерильности этих антибиотиков (см. ниже) или при микробиологическом анализе клинического материала от больных, получающих эти антибиотики. В терапевтических целях их используют в случае тяжелой аллергической реакции на β-лактамные антибиотики. Фермент вво­дят внутримышечно или внутривенно совместно с другими препаратами (адреналин, антигистаминные средства).

Важнейшую область применения ферментов в медицине составляет энзимодиагностика - тестирование патологии того или того органа человека по уровню активности фермента или соотношению его множественных форм и изоферментов. Так, аспартатаминотрансфераза, изоцитратдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа: альдолаза служат для выявления инфаркта миокарда; аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза и лактатдегидрогеаза - для диагностики заболеваний печени; глутамилтрансфера-1 - для блокировки отторжения органов при их пересадке и т.д. Таким образом, производство ферментных препаратов занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и относится к тем ее отраслям, объем продукции, которых постоянно растет, а сфера применения неуклонно расширяется. По объему производства ферментов доминируют страны Западной Европы (фирма “Ново Индастри”, Дания), резкий рост этой индустрии наблюдается в США и Японии.

 

 

РИБОЗИМЫ .

До начала 80-х годов ХХ века основополагающей аксиомой биохимии было утверждение, что все метаболитические реакции происходят с надлежащими для обеспечения жизни скоростями только благодаря высокоэффективным специфическим катализаторам белковой природы - ферментам или энзимам.

Однако в 1981-1982 г. группой американских биохимиков во главе с Т.Чехом было обнаружено, что в природе имеются виды РНК, которые, подобно белкам, обладают высокоспецифической каталитической активностью. Их субстратсвязывающий домен присоединяется к комплементарному участку РНК-мишени с помощью водородных и, возможно, других связей, а каталитический расщепляет ее в специфическом сайте.  Такие РНК-катализаторы были названы рибозимами.

 

 

 

Открытие рибозимов имело огромное теоретическое и практическое значение для биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии.

Во-первых, был положен конец представлению об исключительной роли белков в катализе биохимических реакций. В настоящее время установлено, что рибозимы играют важнейшую роль в процессах синтеза и превращения РНК, например в процессах сплайсинга у эукариот и способны осуществлять практически весь спектр ферментативных реакций (рестрикция, сшивка, трансформации и др.). В настоящее время рибосому тоже принято рассматривать как рибозим. Действительно, все имеющиеся экспериментальные данные свидетельствуют о том, что синтез полипептидной цепи белка в рибосоме катализируется рибосомной РНК, а не рибосомными белками. Идентифицирован каталитический участок большой рибосомной РНК, ответственный за катализ реакции транспептидации, посредством которой осуществляется наращивание полипептидной цепи белка в процессе трансляции.

     Во-вторых, это позволило существенно пересмотреть взгляды на механизмы возникновения жизни и на ранние этапы эволюции. В частности в последнее время активно обсуждается гипотеза “Мира РНК”, как противовес классической теории академика А.И. Опарина. В частности гипотеза “Мира РНК” позволяет решить проблему, на которую долго закрывали глаза практически все ученые - сторонники теории академика А.И. Опарина, а именно, каким образом случайно получившиеся, единичные, удачные белковые молекулы могли копироваться и воспроизводиться в коацерватной капле, а тем более передаваться коацерватам – потомкам.

Накопление знаний о генетическом коде, нуклеиновых кислотах и биосинтезе белков привело к утверждению принципиально новой идеи о том, что все начиналось вовсе не с белков, а с РНК. Нуклеиновые кислоты являются единственным типом биологических полимеров, макромолекулярная структура которых, благодаря принципу комплементарности при синтезе новых цепей, обеспечивает возможность копирования собственной линейной последова-тельности мономерных звеньев, другими словами, возможность воспроизведения (репликации) полимера, его микроструктуры. Поэтому только нуклеиновые кислоты, но не белки, могут быть генетическим материалом, то есть воспроизводимыми молекулами, повторяющими свою специфическую микро-структуру в поколениях.

По ряду соображений именно РНК, а не ДНК, могла представлять собой первичный генетический материал.

Во-первых, и в химическом синтезе, и в биохимических реакциях рибонуклеотиды предшествуют дезоксирибонуклеотидам; дезоксирибонуклеотиды - продукты модифи-кации рибонуклеотидов.

Во-вторых, в самых древних, универсальных процессах жизненного метаболизма широко представлены именно рибонуклеотиды, а не дезоксирибонуклеотиды, включая основные энергетические носители типа рибонуклеозид-полифосфатов (АТФ и т.п.).

В-третьих, репликация РНК может происходить без какого бы то ни было участия ДНК, а механизм редупликации ДНК даже в современном живом мире требует обязательного участия РНК-затравки в инициации синтеза цепи ДНК.

В-четвертых, обладая всеми теми же матричными и генетическими функциями, что и ДНК, РНК способна также к выполнению ряда функций, присущих белкам, включая катализ химических реакций. Таким образом, имеются все основания рассматривать ДНК как более позднее эволюционное приобретение - как модификацию РНК, специализированную для выполнения функции воспроизведения и хранения уникальных копий генов в составе клеточного генома без непосредственного участия в биосинтезе белков.

После того как были открыты каталитически активные РНК, идея первичности РНК в происхождении жизни получила сильнейший толчок к развитию, и была сформулирована концепция самодостаточного мира РНК,предшествовавшего современной жизни. Возможная схема возникновения “Мира РНК” представлена на рис.2.

Абиогенный синтез рибонуклеотидов и их ковалентное объединение в олигомеры и полимеры типа РНК могли происходить приблизительно в тех же условиях и в той же химической обстановке, что постулировались для образования аминокислот и полипептидов. Недавно российскими учеными (Институт белка РАН) было экспериментально показано, что, по крайней мере, некоторые полирибонуклеотиды (РНК) в обычной водной среде способны к спонтанной рекомбинации, то есть обмену отрезками цепи, путем транс-эстерификации. Обмен коротких отрезков цепи на длинные, должен приводить к удлинению полирибонуклеотидов (РНК), а сама подобная рекомбинация способствовать структурному многообразию этих молекул. Среди них могли возникать и каталитически активные молекулы РНК. Даже крайне редкое появление единичных молекул РНК, которые были способны катализировать полимеризацию рибонуклеотидов или соединение (сплайсинг) олигонуклеотидов на комплементарной цепи как на матрице, означало становление механизма репликации РНК. Репликация самих РНК-катализаторов (рибозимов) должна была повлечь за собой возникновение самореплицирующихся популяций РНК. Продуцируя свои копии, РНК размножались. Неизбежные ошибки в копировании (мутации) и рекомбинации в самореплицирующихся популяциях РНК создавали все большее разнообразие этого мира. Таким образом, предполагаемый древний мир РНК - это самодостаточный биологический мир, в котором молекулы РНК функционировали и как генетический материал, и как энзимоподобные катализаторы.

             

 

       Рис. 2 гипотеза А.И. Опарина                          гипотеза ”Мир РНК”

В настоящее время в природе известно только восемь рибозимов, обладающих достаточно низкой каталитической активностью по сравнению с белковыми катализаторами. Возможно раньше, рибозимов было гораздо больше, и они обеспечивали все многообразие необходимых для биосинтеза реакций, а затем они исчезли в процессе эволюционного отбора наиболее эффективных способов хранения и обработки наследственной информации. Что касается низкой эффективности катализа рибозимами, то у эволюции, было, достаточно времени и ее начальные стадии могли проходить очень медленно.

В последнее время в лабораториях разных стран проводятся работы по искусственному синтезу различных рибозимов. Наибольших успехов достигла группа во главе с Д. Бартелом. Используя разработанную ими селекс-технологию (метод эволюции искусственного мира РНК в пробирке) они синтезировали 65 новых рибозимов и сумели повысить их активность в десятки и сотни раз.

В третьих, рибозимы могут использоваться как высокоэффективные лекарственные препараты направленного действия для генной терапии. В большинстве методов генной терапии ех vivo и in vivo используются клонированные генетические конструкции, возмещающие функциональную форму белка, который не синтезируется в организме больного или синтезируется в дефектной форме. Однако многие заболевания человека (рак, воспаления, вирусные и паразитарные инфекции) связаны, напротив, с гиперпродукцией нормального белка. Для лечения таких состояний разработаны терапевтические

системы с использованием олигонуклеотидов. Небольшой олигонуклеотид может либо гибридизоваться со специфическим геном или мРНК и снижать уровень транскрипции или трансляции, уменьшая тем самым количество синтезируемого белка, ответственного за патологию (“антигенные” или “антисмысловые” нуклеотиды) либо разрушать их (дезоксирибозим или рибозим).

Создание «терапевтического» рибозима - сложный процесс. Связано это с трудностью получения больших количеств синтетических РНК и сохранения их в нативном состоянии в клетке-мишени. Модифицируя субстрат - связывающую последовательность нуклеотидов с помощью методов генной инженерии, получают рибозимы, расщепляющие специфические мРНК и подавляющие трансляцию белка, ответственного за развитие того или иного заболевания. Рибозимы, созданные методами генной инженерии, можно использовать для лечения рака и вирусных инфекций.

Природных ДНК-ферментов (дезоксирибозимов) пока не обнаружено, но уже синтезиро­ваны олигодезоксинуклеотиды, обладающие каталитической активностью. Преимущество дезоксирибозимов состоит в том, что для их по­лучения не нужно использовать экспрессирующий вектор: ДНК-ферменты можно просто упаковать в липосомы и доставить в клетку-мишень. Однако создание эффективных ДНК-ферментов находится пока на начальном этапе развития.

 

 

ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

 

Инженерная энзимология - это отрасль биотехнологии, базирующаяся на использовании каталитических функций ферментов (или ферментных систем) в изолированном состоянии или в составе живых клеток для получения соответст­вующих целевых продуктов. Биообъект здесь - фермент (или комплекс ферментов).

Развитие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось дороговизной чистых ферментных препаратов, неустойчивостью их при хранении и невозможностью многократного использова­ния. Принципиально новые перспективы открылись перед при­кладной энзимологией в 60-е годы XX в. в результате появления на стыке химии и биологии новой отрасли - инженерной энзи­мологии. Ее задачи заключаются в развитии прогрессивных мето­дов выделения ферментов, их стабилизации и иммобилизации, а так же разработке научных основ их применения. Слово "инженерная" здесь привносит свою специфику, заключающуюся в акценте на целенаправленное создание конструкции (от франц. engin - машина), в данном случае - на конструирование молекул ферментов-биокатализаторов с задан­ными свойствами, более эффективных, чем существующие в природе, с последующим использованием в биотехноло­гическом процессе.

Классические методы селекции и мутагенеза (отбор случайных мутаций, индуцированный мутагенез) малопригодны для решения этой задачи, т. к. изменения генома, а значит и аминокислотные замены в молекулах ферментов будут носить случайный, неконтролируемый характер. Химическая модификация аминокислотных остатков в белковой молекуле чрезвычайно сложна и реально можно заменять только концевые остатки аминокислот (химическая трансформация свиного инсулина в человеческий).

Получение ферментов с заданными свойствами стало возможно только после возникновения науки-генетической инженерии и одного из ее направлений, получившего название - технология направленного мутагенеза. При осуществлении направленного мутагенеза, в отличие от классической генетической инженерии, осуществляется не введение или замена целого гена в хромосоме, а избирательно заменяются одна или несколько пар нуклеотидов в гене, отвечающим за синтез нужного фермента. Такая замена нуклеотидов приводит к такой же определенной замене остатков аминокислот в белковой молекуле, а это в свою очередь изменяет субстратную специфичность и физико-химические свойства фермента. Так, замена остатка глутамина-102 в молекуле лактатдегидрогеназы на аргинин превратила фермент в высокоактивную малатдегидрогеназу. Описанным способом получены термостабильные формы лизоцима Т-4 и субтилизина (каталитическая константа субтилизина изменена в 100 раз), созданы гибридные формы фер­ментной системы, ценной в иммуноферментном анализе, сочета­ющие в себе свойства β-галактозидазы и β -галактокиназы.

Поскольку число вариантов таких замен огромно, то для достижения нужного результата (повышения активности и стабильности фермента) необходимо знать аминокислотный состав, трехмерную пространственную структуру и свойства модифицируемой белковой молекулы, а так же пространственную структуру молекулы субстрата.

Основная сложность заключается в том, что не всегда известно, какую аминокислоту или последовательность аминокислот нужно изменить, чтобы получить белок с нужными свойствами. Изменения могут затрагивать аминокислотные остатки, расположенные в разных участках полипептидной цепи, которые потом сближаются при укладке белковой молекулы. Выбор аминокислоты, подлежащей замене, как правило, производится эмпирически, с учетом ее роли в функционировании белка. Данные об этом получают в ходе биохимических исследований или в методом рентгеноструктурного анализа трехмерной структуры белка или лучше комплекса белок - лиганд(субстрат). Поэтому положительный результат пока достигается достаточно редко.

В последнее время значительное развитие получил перспективный подход к получению высокоактивных белков, основанный на использовании методов компьютерного молекулярного дизайна (технология молекулярного докинга). В качестве примера можно привести работу сотрудников биологичекого факультета МГУ по созданию эффективных биокатализаторов-ферментов, значительно превосходящих природные аналоги.

В качестве модели был взят фермент пенициллинацилаза из Е. Coli , который широко применяется в фармацевтических производствах для получения полусинтетических пенициллинов. Его химическая и пространственная трехмерная структура установлена уже довольно давно. С помощью специально разработанной компьютерной программы было смоделировано улучшение свойств этого фермента. Для повышения активности и специфичности фермента виртуально варьировались (заменялись) аминокислотные остатки его активного центра, которые участвуют в связывании субстрата. Для каждой мутации проверялось (виртуально, методом молекулярного докинга) сродство новой формы активного центра фермента к субстрату. Мерой сродства служила расчитанная величина энергии связывания субстрата с виртуальной молекулой фермента. Всего было виртуально проскринировано более 3000 мутантных форм фермента, несущих произвольные одиночные и двойные мутации, среди которых были обнаружены мутантные формы, связывающие субстрат почти в 100 раз лучше природного фермента. Далее зная структуру такого высокоэффективного мутанта можно искусственно сконструировать фрагмент ДНК, кодирующий его аминокислотную последовательность и в дальнейшем клонировать и получить его в подходящем организме – хозяине.

В настоящее время подобные исследования являются достаточно дорогими и трудоемкими и в основном еще не вышли за рамки научных лабораторий. Есть надежда, что уже в ближайшем будущем развитие протеомики, аналитической и компьютерной техники позволит точно и быстро предсказывать свойства того или иного белка, исходя из данных о его аминокислотной последовательности. Это значительно упростит процедуру искусственного создания нужных белков с заданными свойствами.

Важным этапом развития инженерной энзимологии стала раз­работка способов получения и использования иммобилизованных ферментов.

 

 

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ

 

Иммобилизованными ферментами называются ферменты, ис­кусственно связанные с нерастворимым в воде носителем, но сохраня­ющие свои каталитические свойства. При этом нерастворимый носитель представляет собой частицу (гранулу, нить, пространственную конструкцию с развитой поверхностью) размер которой на много порядков больше размера самой крупной молекулы фермента. Такую частицу можно видеть невооруженным глазом, держать в руках, загружать в различные устройства. Таким образом ферментативный катализ из гомогенного процесса, протекающего во всем объеме реакционной среды, превращается в гетерогенный, протекающий на поверхности такого носителя.

Еще в 1916 г. Дж. Нельсон и Е. Гриффин показали, что фермент сахараза, сорбированная на угле, сохраняла свою каталитическую ак­тивность, но лишь в 1953 г. Н. Грубхофер и Д. Шлейт впервые осу­ществили ковалентные связывания амилазы, пепсина, РНКазы и карбоксипептидазы с нерастворимым носителем без потери активности иммобилизуемого фермента.

В 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии был узаконен термин «иммобилизованные ферменты». Однако в понятие «иммобилизация» в настоящее время вкладывают более широкий смысл, чем связывание на нерастворимом носителе, а именно - полное или частичное ограничение свободы движения белковых молекул или клеток.

Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами. Прежде всего, такие фер­менты, представляя собой гетерогенные катализаторы, которые легко от­деляются от реакционной среды и могут использоваться многократ­но без потери активности, обеспечивая таким образом непрерывность каталитического процесса при сохранении асептических условий. Кроме того, иммобилизация ведет к изменению свойств фермента: суб­стратной специфичности, устойчивости, зависимости активнос­ти от параметров среды. Иммобилизованные ферменты долговеч­ны и в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. Так, происходящая при температуре 65 °С термоинактивация лактатдегидрогеназы, иммобилизованной в 60 %-м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативным фер­ментом. Все перечисленное обеспечивает высокую экономичность, эффектив-ность и конкурентоспособность технологий, использу­ющих иммобилизованные ферменты.     

     1. Носители для иммобилизованных ферментов. Считается, что идеальные материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими основ­ными свойствами: нерастворимостью в воде; высокой химической и био­логической стойкостью; значительной гидрофильностью (смачиваемостью); доста­точной проницаемостью, как для ферментов, так и для коферментов, субстратов и продуктов реакции; способностью носителя легко активироваться (переходить в реакционно-способную форму). Кроме того материал носителя должен быть нетоксичным для человека и микроорганизмов-продуцентов, а так же не влиять на физико-химические свойства реакционной среды (значение рН, концентрацию определенных ионов), которые могут повлиять на активность фермента.

Естественно, ни один из используемых в настоящее время в качестве носителя материал не отвечает полностью перечислен­ным требованиям. Тем не менее, существует широкий набор носи­телей, пригодных для иммобилизации определенных энзимов в конкретных условиях.

В зависимости от природы носители делятся на органические и неоргани-ческие материалы.

Органические полимерные носители. Иммобилизация многих ферментов осуществляется на полимерных носителях органичес­кой природы. Существующие органические полимерные носите­ли можно разделить на два класса: природные и синтетические полимерные носители. В свою очередь, каждый из классов орга­нических полимерных носителей подразделяется на группы в за­висимости от их строения. Среди природных полимеров выделя­ют белковые, полисахаридные и липидные носители, а среди синтетических- полиметиленовые, полиамидные и полиэфир­ные.

К преимуществам природных носителей следует отнести их доступность, полифункциональность и гидрофильность, а к недо­статкам - биодеградируемость и достаточно высокую стоимость.

Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто исполь­зуют целлюлозу, декстран, агарозу (агар) и их производные. Для прида­ния химической устойчивости линейные цепи целлюлозы и декстрана поперечно сшивают эпихлоргидрином. В полученные сет­чатые структуры довольно легко вводят различные ионогенные группировки. Химической модификацией крахмала сшивающими агентами (формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) син­тезирован новый носитель - губчатый крахмал, обладающий по­вышенной устойчивостью к гликозидазам.

Из природных аминосахаридов в качестве носителей для иммобилизации применяют хитин, который в значительных коли­чествах накапливается в виде отходов в процессе промышленной переработки крабов и креветок. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру.

Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли структурные протеины, такие, как кератин, фиброин, коллаген и продукт переработки коллагена - желатина. Эти белки широко распространены в природе, поэтому доступны в значи­тельных количествах, дешевы и имеют большое число функцио­нальных групп для связывания фермента. Белки способны к био­деградации, что очень важно при конструировании иммобилизо­ванных ферментов для медицинских целей. К недостаткам белков как носителей в этом случае следует отнести их высокую иммуногенность.

Синтетические полимерные носители. Благодаря разнообразию и доступности материалы этой группы широко используются как носители для иммобилизации. К ним относятся полимеры на ос­нове стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта; по­лиамидные и полиуретановые полимеры. Большинство синтети­ческих полимерных носителей обладают механической прочнос­тью, а при образовании обеспечивают возможность варьирования в широких пределах величины пор, введения различных функци­ональных групп. Некоторые синтетические полимеры могут быть произведены в различных физических формах (трубы, волокна, гранулы). Все эти свойства полезны для разных способов иммоби­лизации ферментов.

Носители неорганической природы. В качестве носителей наи­более часто применяют материалы из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды ме­таллов. Их можно подвергать химической модификации, для чего носители покрывают пленкой оксидов алюминия, титана, гаф­ния, циркония или обрабатывают органическими полимерами. Основное преимущество неорганических носителей - легкость регенерации, механическая и химическая прочность. Подобно синтетическим полимерам неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости.

Таким образом, к настоящему времени создано огромное число разнооб­разных носителей для иммобилизации ферментов. Однако для каж­дого индивидуального фермента, используемого в конкретном тех­нологическом процессе, необходимо подбирать оптимальные варианты, как носителя, так и условий и способов иммобилизации.

 

     2.Методы иммобилизации ферментов. Существуют два принципиально различных метода иммобили­зации ферментов: без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (химические методы иммобилизации). Каждый из этих методов осуществляется разными способами.

Рис.3. Методы иммобилизации ферментов (ф-молекула фермента)

Физические методы иммобилизации ферментов реализуются либо посредством адсорбции фермента на нерастворимом носителе, либо путем включения их в поры поперечносшитого геля, в по­лупроницаемые структуры или различные двухфазные системы.

Адсорбция ферментов на нерастворимых носителях.При ад­сорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей. Адсорбция была первым методом иммобилизации ферментов (Дж. Нель-сон, Э.Гриффин, 1916), но и сейчас не потеряла своего значения и стала наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментов в промышленности. В литературе описано получение адсорбционным способом более 70 иммобили­зованных ферментов с использованием главным образом таких но­сителей, как кремнезем, активированный уголь, графитовая сажа, различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетические полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов. Последние применяются наиболее часто. Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя. Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается край­ней простотой и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешива­нии, динамическим способом с использованием колонок). С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, напри­мер, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Актив­ность фермента при таком варианте иммобилизации сохраняется практически на 100 %, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1 г носителя.

К недостаткам адсорбционного метода следует отнести невы­сокую прочность связывания фермента с носителем. При измене­нии условий иммобилизации могут происходить десорбция фермента, его потеря и загрязнение продуктов реакции. Существенно повысить прочность связывания фермента с носителем может предварительная его модификация (обработка ионами металлов, полифункциональными агентами - полимерами, белками, гид­рофобными соединениями, монослоем липида и пр.). Иногда, наоборот, модификации подвергается молекула исходного фермента, однако зачастую это ведет к снижению его активности.

Иммобилизация ферментов путем включения в гель.Способ иммобилизации ферментов путем включения в трехмерную структуру полимерного геля широко распространен благодаря своей простоте и уникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных ферментов, но и мультиэнзимных комплексов и даже интактных клеток. Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами. В первом случае фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами фермента. Во втором случае фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поли-винилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля, для второго - гели крахмала, агар-агара, каррагинана, агарозы, фосфата кальция.

Иммобилизация ферментов в гелях обеспечивает равномерное распределение энзима в объеме носителя. Большинство гелевых матриц обладает высокой механической, химической, тепловой и биологической стойкостью и обеспечивает возможность многократного использования фермента, включенного в его структуру. Однако метод непригоден для иммобилизации ферментов, действующих на водонерастворимые субстраты. Многие субстраты с большим размером молекул так же могут не проникнуть в поры такого геля.

Иммобилизация ферментов в  полупроницаемые структуры. Сущность этого способа иммобилизации заключается в отделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помо­щью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолеку­лярные молекулы субстратов и кофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано несколько модификаций этого метода, из которых интерес представляет микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы.

Первый способ предложен Т.Чангом в 1964 г. и состоит в том, что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой микрокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым полимером. Один из механизмов возникновения мембраны на поверхности водных микрокапсул фермента заключается в реакции межфазной поликонденсации двух соединений, одно из которых растворено в водной, а другое - в органической фазе. Примером может служить образование на поверхности раздела фаз микрокапсулы, получаемой путем поликонденсации гексаметилендиамина-1,6 (водная фаза) и галогенангидрида себациновой кислоты (органическая фаза):

                                                     _{- HCl}

H ₂ N -( CH ₂ )₆- NH ₂ + С lO С-(СН₂)₈-СОС1 → HN -( CH ₂ )₆- NH - СО-(СН₂)₈-СО-

 

Размер получаемых капсул составляет десятки или сотни микрометров, а толщина мембраны - сотые доли микрометра.

Достоинства метода микрокапсулирования - простота, универсальность, возможность многократного использования нативного фермента (фермент может быть отделен от непрореагировавшего субстрата и продуктов реакции процедурой простого фильт­рования). Особенно существенно, что методом микрокапсулиро­вания могут быть иммобилизованы не только индивидуальные ферменты, но и мультиэнзимные комплексы, целые клетки и отдельные фрагменты клеток. К недостаткам метода следует отнести невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.

Близким к инкапсулированию методом иммобилизации можно считать включение водных растворов ферментов в липосомы, представляющие собой сферические или ламеллярные системы двойных липидных бислоев. Впервые данный способ был применен для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 г. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В процессе диспергирования происходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенный раствор фермента.

Ферменты, иммобилизованные путем включения в структуру липосом, используют преимущественно в медицинских и научных целях, ибо значительная часть ферментов в клетке локализована в составе липидного матрикса биологических мембран, поэтому изучение липосом имеет большое значение для понимания закономерностей процессов жизнедеятельности в клетке.

Другие приемы иммобилизации ферментов, основанные на физических методах, менее распространены по сравнению с рассмотренными выше.

Химические методы иммобилизации ферментов. Иммобилизация ферментов путем образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем - наиболее массовый способ получения промышленных биокатализаторов.

В отличие от физических методов этот способ иммобилизации обеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носителем и часто сопровождается стабилизацией молекулы энзима. Однако расположение фермента относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создает стерические трудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отделяют от носителя с помощью специальной вставки (сшивка, спейсер), в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.). Например, для выведения галактозилтрансферазы из микроокружения носителя между ним и ферментом вставляют последовательность —СН₂— NH —(СН₂)₅—СО—. В этом случае структура иммобилизованного фермента включает носитель, вставку и фермент, соединенные между собой ковалентными связями.

 

Рис.4. Схема иммобилизации фермента химическим методом

 

Принципиально важно, чтобы в иммобилизации фермента уча­ствовали функциональные группы, не существенные для его каталитической функции (функциональные группы активного центра). Так, гликопротеины обычно присоединяют к носителю через углеводную, а не через белковую часть молекулы фермента. Если это условие не соблюдается, то химическая иммобилизация может привести к полной потере ферментативной активности.

Число методических приемов, разработанных для осуществления ковалентной иммобилизации ферментов, исключительно велико. Все методы химической иммобилизации классифицируют в зависимости от природы реакционной группы носителя, вступающей во взаимодействие с молекулой фермента. Ниже представ­лен ряд примеров, иллюстрирующих некоторые способы химической иммобилизации ферментов.

Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих гидроксо-группами.Наиболее распространенным методом образования ковалентной связи между ферментом и полисахаридным носителем или синтетическим диольным 

соединением является бромциановый метод, который был предложен Р.Аксеном,

 Дж. Поратом и С.Эрнбаком в 1967 г. При обработке носителя бромцианом возникают реакционноспособные цианаты и имидокарбонаты, которые при взаимодействии с нуклеофильными аминогруппами фермента образуют производные изомочевины и уретанов:

 

Иммобилизация ферментов носителях, обладающих аминогруппами. Первичные аминогруппы носителя, связанные с аро­матическим кольцом, предварительно превращают в соли диазония, которые затем подвергают разнообразным реакциям сочетания. В реакции сочетания вступают фенольные, имидазольные, аминные, гуанидиновые, тиольные группы белков. Так, в щелочной среде фенольные радикалы тирозина образуют прочные азо-соединения, в составе которых белок связан с носителями:

Существенно, что п-аминофенильные функции могут быть легко введены в разнообразные носители.

Иммобилизация на носителях, обладающих активированными производными карбоксильной группы.Наиболее часто для соедине­ния аминогрупп белка с ацильными группировками носителя используют ангидриды, галогенангидриды, активированные эфиры и другие производные карбоновых кислот. Например,

Реакционная способность производных карбоновых кислот в реакциях ацилирования аминогрупп фермента уменьшается от галогенангидридов до эфиров.

Иммобилизация на носителях, обладающих сульфгидрилъными группа-ми. Сульфгидрильные группы носителя и фермента легко окисляются с образова-нием дисульфидных связей под действием кислорода воздуха:

 

 

ИММОБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК

 

Рассмотренные выше методы иммобилизации универсальны для всех видов иммобилизованных биокатализаторов - индивидуальных ферментов, клеток, субклеточных структур, комбинированных препаратов.

Несмотря на все преимущества иммобилизованных ферментов перед неиммобилизованными их широкое применение сдерживается несколькими отрицательными факторами.

1. Прежде всего это высокая стоимость получения таких препаратов. Фермент сначала нужно получить, выделить его в чистом виде и затем провести процедуру иммобилизации.

2. Многие ферменты-протеиды, содержащие коферментные группы или кофакторы невозможно выделить в чистом виде без потери активности.

3. Процессы иммобилизации, как правило, проводятся вслепую и часто сопровождаются снижением активности фермента.

4. Любой фермент способен осуществить лишь определенное число актов катализа, после чего он выходит из строя. Поэтому такие катализаторы обладают коротким сроком действия, после чего их нужно заменять. С учетом высокой стоимости иммобилизованных ферментов это во многих случаях сводит на нет преимущества их использования.

Поэтому, наряду с иммобилизацией ферментов в последнее время все большее внимание уделяется иммобилизации клеток и субклеточных структур. Это объясняется тем, что при использовании иммобилизованных клеток отпадает необходимость выделения и очистки ферментных препаратов, а непрерывное воспроизводство клеткой своих ферментов позволяет осуществлять процессы в течение длительного времени. Кроме того иммобилизация клеток на крупных частицах носителя позволяет легко отделять их на завершающей стадии от культуральной жидкости без повреждений с сохранением асептики. Это позволяет использовать такие клетки многократно и отказаться от сложной и трудоемкой операции предварительной наработки биомассы продуцента.

Использование иммобилизованных клеток имеет и целый ряд недостатков:

1. Иммобилизованная живая клетка в отличие от молекулы фермента нуждается в питательной среде и выделяет различные метаболиты, что приводит к загрязнению целевого продукта.

2. Аэробные клетки нуждаются в кислороде и выделяют углекислый газ. Поэтому такой ферментер необходимо снабжать системами аэрирования, отвода газов и пеногашения, что усложняет и удорожает его конструкцию.

3. Растущие в размерах и делящиеся клетки разрушают структуру носителя. Образующиеся при делении дочерние клетки, покидая носитель, загрязняют целевой продукт. Поэтому в промышленных процессах для иммобилизации чаще используют покоящиеся клетки или споры бактерий. Для подавления роста иммобилизованных клеток растений используют дефицит фитогормонов, а рост клеток бактерий тормозят добавлением антибиотиков.

4. Большинство клеточных ферментов являются эндометаболитами, т.е. локализованы внутри клетки. Поэтому трансформируемый субстрат сначала должен проникнуть в клетку через клеточную стенку, а это не всегда возможно. В этом случае приходиться использовать клетки с частично поврежденной клеточной стенкой, а это значительно сокращает срок их жизни, а значит и срок работы биокатализатора.

Поэтому выбор между использованием иммобилизованных или неиммобилизованных клеток или ферментов для каждого конкретного процесса осуществляют исходя из нескольких основных критериев:

1. Особенности процесса (одностадийный или многостадийный, известен или не известен механизм процесса и отвечающий ему фермент и т. д.).

2. Значимость для человека (потребительская стоимость продукта). Если продукт является жизненно важным лекарством, дорогим и труднодоступным, то следует использовать вариант процесса, позволяющий получить этот продукт в максимально большом количестве. Себестоимость в этом случае не является решающим фактором.

3. Если продукт крупнотоннажный с низкой себестоимостью, то основным критерием выбора будет максимальная дешевизна получения.

Иммобилизованные ферменты и клетки микроорганизмов применяют для биотрансформации органических соединений, разделения рацемических смесей, гидролиза ряда сложных эфиров, инверсии сахарозы, восстановления и гидроксилирования стероидов. Иммо­билизованные хроматофоры используют в лабораторных установках для синтеза АТФ, а пурпурные мембраны - для создания искусственных фотоэлектрических преобразователей - аналогов солнечных батарей. Разрабатывается реактор на основе иммобилизованных клеток дрожжей для получения этанола из мелассы, в котором дрожжи сохраняли бы способность к спиртовому броже­нию в течение 1800 ч. Из более чем 2000 известных в настоящее время ферментов иммобилизована и используется для целей ин­женерной энзимологии примерно десятая часть (преимуществен­но оксидоредуктазы, гидролазы и трансферазы).

Для осуществления химических процессов с помощью иммо­билизованных ферментов и клеток применяют колоночные, трубчатые, пла­стинчатые и танкерные реакторы разного объема и производи­тельности. Иммобилизованные биокатализаторы функциони­руют в биореакторе в виде неподвижной фазы, через которую про­текает среда с субстратом, подлежащим химическому превраще­нию (гетерогенный катализ). В таких реакторах наряду с непрерыв­ным режимом используется и периодический. Для эффективного перемешивания и газообмена биореактор снабжают мешалкой. По­вреждающее действие мешалки на биокатализатор устраняют, зак­репляя определенным образом его гранулы. Например, в биореак­торе «корзиночного» типа мешалка вращается в полом цилиндре из сетчатой структуры (корзина), в ячейках которой закреплен им­мобилизованный фермент. Во внутреннем объеме трубчатых реак­торов рыхло расположены полые волокна, заполненные биоката­лизатором. Степень превращения субстрата в продукт (например, фумарата аммония в аспартат) в таких реакторах достигает 90 %.

 

 

---

Дата добавления: 2019-02-13; просмотров: 268; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!