Раздел 4. Лабораторная диагностика паразитозов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР-диагностика)

Введение

В разделе приведено описание методов определения криптоспоридий, бластоцист, дирофилярий и лейшманий в различных биологических средах, разработанные в ИМПиТМ им.Е.И.Марциновского. Методы основаны на идентификации их ДНК с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Описаны скрининговые методы, направленные на выявление регуляторных последовательностей. Идентификация этих регуляторных последовательностей позволяет проводить ДНК-диагностику паразитарных инвазий, но не может применяться при проведении количественного анализа содержания ДНК. Методы, применяемые при отборе проб, выделения ДНК для проведения анализов, проведения электрофореза, документирования и анализа получаемых данных, а также вопросы организации рабочего места являются обязательными к исполнению при проведении как скрининговых, так и идентификационных анализов.

Все представленные в настоящих методических указаниях методы являются качественными и состоят из следующих этапов: выделение ДНК, амплификация целевой ДНК с соответствующими праймерами, электрофорез продуктов амплификации в агарозном геле, документирование и анализ результатов.

Данная методика может быть выполнена на стандартном оборудовании с использованием стандартного набора реагентов в любой оборудованной ПЦР-лаборатории в учреждениях Роспотребнадзора, медицинских учреждениях Российской Федерации вне зависимости от ведомственной принадлежности, а также в лабораториях ПЦР-диагностики других ведомств.

ПЦР-диагностика токсоплазмоза и мочеполового трихомоноза проводятся с использованием коммерческих ПЦР-тест-систем для определения Toxoplasma gondii и Trichomonas vaginalis и зарегистрированных в России в установленном порядке.

Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы

Аппаратура и инструменты

Амплификатор типа "Терцик МС-2" со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5 °С/с

Прибор для горизонтального электрофореза типа "Sub Cell GT System" с комплектом кювет и гребенок

Источник напряжения типа "Power Рас 300" с диапазоном регулируемого напряжения 50-300 В

Видеосистема типа "Gel Doc 2000

", предназначенная для ввода в компьютер, анализа и документирования изображений люминесцирующих следов ДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием: диапазон излучения 300-400 нм, чувствительность - не менее 10 нг ДНК (по бромистому этидию)

Холодильник бытовой электрический

ГОСТ 26678

Камера морозильная, обеспечивающая температуру -20 °С

Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф (частота вращения не менее 13000 мин

)

Термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 до 120 °С, количество гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры - 0,2 °С, разность температур между соседними ячейками - не более 0,5 °С

Аппарат для встряхивания типа "Вортекс", скорость вращения 250-3000 мин

Печь микроволновая (мощностью не менее 400 W)

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г

ГОСТ 24104

Анализатор потенциометрический, погрешность измерений рН=0,01

ГОСТ 19881-74

Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные

ГОСТ 19569*

______________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51935-2002. - Примечание изготовителя базы данных.

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды

ГОСТ 6709-72

Гомогенизатор перистальтического типа "Стомайкер" или других моделей

Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов

ТУ 16-535-84*

________________

* ТУ, упомянутые здесь и далее по тексту, не приводятся. За дополнительной информацией обратитесь по ссылке. - Примечание изготовителя базы данных.

Дозаторы с переменным объемом дозирования:

0,2-2,0 мкл с шагом 0,01 мкл, точностью = 1,2%;

0,5-10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, точностью = 0,8%;

2-20 мкл с шагом 0,01 мкл, точностью = 0,8%;

20-200 мкл с шагом 0,1 мкл, точностью = 0,6%;

100-1000 мкл с шагом 1 мкл, точностью = 3%;

2-10 мл с шагом 0,1 мл, точностью = 0,5%

Пинцет медицинский

ГОСТ 21241-89

Примечание. Допускается использование другой аппаратуры и инструментов с техническими характеристиками, не хуже указанных выше, отечественного и зарубежного производства, разрешенных для применения в установленном порядке.

Лабораторная посуда и материалы


Бумага фильтровальная лабораторная	ГОСТ 12026-76
Воронки стеклянные	ГОСТ 25336-82
Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические, вместимостью 25, 50, 100, 200, 1000 мл	ГОСТ 12738-77
Цилиндры стеклянные мерные лабораторные, вместимостью 25, 100, 1000 мл	ГОСТ 1770-74
Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф, вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 мл
Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10, 20, 200, 1000 мм ; 10 см

Реактивы


Кислота соляная, х.ч.	ГОСТ 3118-77
Кислота борная, х.ч.	ГОСТ 9656-75
Натрия гидроокись, ч.д.а.	ГОСТ 4328-77
Натрий хлористый, х.ч.	ГОСТ 4233-77
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), х.ч.	ТУ 6-09-11-1721-83
Гексадецилтриметиламмоний бромид (СТАВ)	кат. N Н 5882
Трис (оксиметил) аминометан, х.ч.	ТУ 6-09-4292-76
Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА)	кат. N В 4287
Этидий бромистый, х.ч.	ТУ 6-09-13-452-75
Спирт этиловый ректификованный	ГОСТ Р 51652-2000
Спирт изопропиловый, х.ч.	ТУ 6-09-402-85
Масло вазелиновое медицинское	ГОСТ 3164-78
Хлороформ, х.ч.	ГОСТ 20015-88
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-72
Вода деионизированная	ОСТ 11.029.003-80*
_______________ * ОСТ 11.029.003-80 не действует с 01.07.1993 г. - Примечание изготовителя базы данных.
2-меркаптоэтанол, х.ч.	ТУ 6-09-08-1024-81
Термостабильный фермент Taq-полимераза, оптимум работы в области 70-72 °С	кат. N Д 1806
Буфер для ПЦР с	кат. N Р 2192
Агароза для электрофореза (тип П)	кат. N А 6877
Маркер молекулярной массы ДНК	кат. N Р 1473
Праймеры

Примечание. Допускается использование других реактивов с техническими характеристиками, не хуже указанных выше, препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9 000* или EN 29 000*.

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым здесь и далее по тексту, можно получить, перейдя по ссылке на сайт http://shop.cntd.ru. - Примечание изготовителя базы данных.

Подготовка к анализу

Приготовление растворов

1) Приготовление 1М ТРИС - (рН 7,5)

В мерной колбе на 100 мл растворить 12,11 г Трис (оксиметил) аминометана (молекулярная масса 121) в 80 мл дистиллированной воды, довести рН до 7,5 концентрированной соляной кислотой, затем довести объем раствора до метки деионизованной водой, перемешать, хранить при температуре -20 °С не более года.

2) Приготовление 5M

Растворить 29,22 г натрия хлористого (молекулярная масса 58,5) в 100 мл дистиллированной воды, перемешать, хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.

3) Приготовление 30%-го

Растворить 3 г натрия гидроокиси (молекулярная масса 40) в 7 мл дистиллированной воды.

4) Приготовление 0,5М ЭДТА (рН 8,0)

В мерной колбе на 100 мл растворить 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярная масса 372,2) в 80 мл дистиллированной воды. Довести: 30%-м раствором натрия гидроокиси рН раствора до 8,0; дистиллированной водой - объем раствора до метки, перемешать. Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.

Приготовленные растворы автоклавировать при 1 атм., 121 °С 15-20 мин или фильтровать через мембраны Millipore 0,4 мкм.

5) Приготовление хлороформа, насыщенного водой

Смешать 100 мл хлороформа с 20 мл деионизированной воды и оставить на 24 ч для насыщения. Срок хранения при температуре от 4 до 5 °С - не более 6 месяцев.

6) Приготовление 70%-го раствора этилового ректификованного спирта

Смешать 70 мл 96%-го этилового спирта с 26 мл деионизированной воды. Срок хранения при температуре от 4 до 5 °С - не более 2 месяцев.

7) Приготовление раствора БСА (20 мкг/мл)

Растворить 0,002 г сухого альбумина бычьего сывороточного в 1 мл деионизированной воды, 10 мкл полученного раствора смешать с 990 мкл деионизированной воды.

Срок хранения в морозильной камере при температуре -20 °С - не более 6 месяцев.

8) Приготовление лизирующего буфера (2%-го раствора "СТАВ")

Растворить 0,5 г гексадецилтриметиламмония бромида в 10 мл деионизированной воды (при плохом растворении подогреть на водяной бане), добавить 2,5 мл 1М Трис- , 7 мл 5М , 1 мл 0,5 М ЭДТА, доводят объем раствора деионизированной водой до 25 мл, перемешивают. Срок хранения при температуре от 4 до 5 °С - не более 6 месяцев, допустимо образование осадка.

Перед использованием раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате при температуре 65 °С до полного растворения осадка.

Непосредственно перед использованием в приготовленный лизирующий буфер вносят меркаптоэтанол из расчета 4 мм на 1 см лизирующего буфера и перемешивают.

При проведении электрофореза использовать один из ниже перечисленных буферов.

1) Приготовление 1 ТВЕ буфера для электрофореза

В мерной колбе на 1000 мл растворить 10,8 мг Трис (оксиметил) аминометана, 5,5 г борной кислоты и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, довести дистиллированной водой до метки, перемешать до полного растворения.

Срок хранения 1 раствора - 10 дней, обычно готовят 10 и перед употреблением разбавляют до 1 , используют максимум три раза.

2) Приготовление 1 ТАЕ буфера для электрофореза

В мерную колбу вместимостью 1000 мл внести 242 г Трис-основания, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл 0,5 М ЭДТА, долить деионизованную воду до метки. Полученный 50 раствор перед употреблением развести в 50 раз.

Использовать для проведения электрофореза не более двух раз.

3) Приготовление раствора бромистого этидия - (10 мг/мл)

Растворить 1 г бромистого этидия в 100 мл дистиллированной воды.

Срок хранения в посуде темного стекла - обязательно при температуре от 4 до 5 °С - не более 12 месяцев.

4) Приготовление 2%-го раствора агарозного геля

Добавить 2 г агарозы к 100 мл буфера ТАЕ (1 ).

Нагреть смесь в микроволновой печи (не доводя до кипения) до полного растворения агарозы.

Охладить раствор агарозы до 50-55 °С и добавить бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

Залить раствор в специальную камеру для заливки агарозной гели и немедленно вставить гребенки для формирования лунок.

Оставить гель до полного остывания при комнатной температуре ( мин).

Допускается хранение готового геля в 1 буфере для электрофореза в холодильнике при температуре от 4 до 5 °С - не более 2 суток.

Отбор, хранение и транспортирование клинического материала

1) На обнаружение простейших кишечника

Кал в количестве 1 г забирается в стерильный флакон и в течение первых двух часов доставляется в бактериологическую лабораторию с оформленным направлением.

2) На обнаружение возбудителей дирофиляриозов

Кровь должна быть нативной (не свернувшейся). Для проведения исследований крови методом ПЦР момент забора крови не имеет значения. Кровь венозную собрать в стерильную пробирку (2-3 мл) с антикоагулянтом ЭДТА, аккуратно перемешать, плавно переворачивая пробирку, и поместить в холодильную камеру (4-8 °С).

Внимание! Нельзя использовать гепарин в качестве антикоагулянта!

Образцы могут находиться при комнатной температуре не более 2 ч. При необходимости более длительного хранения пробы могут быть помещены в холодильник с температурой 2-8 °С на срок не более суток. Более продолжительное хранение (до 2 недель) допустимо в замороженном виде в морозильной камере при температуре -20 °С. Не допускается повторное замораживание-оттаивание проб.

Транспортирование клинических образцов должно осуществляться в термосах или термоконтейнерах с соблюдением правил хранения образцов и правил транспортирования инфекционных материалов.

В лабораторию следует доставлять промаркированные пробирки или предметные стекла, фильтровальную бумагу в индивидуальных конвертах, к ним прилагается документ с Ф. И. О. пациента, возрастом и кратким анамнезом.

Дата добавления: 2019-02-12; просмотров: 266; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 22 23 24 25 262728 29 30 31 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!