Определение общего количества микробов в воде.
Определение начинают с приготовления разведений воды. Для этого в несколько пробирок наливают по 9 мл стерильной воды, В первую пробирку одной стерильной пипеткой добавляют 1 мл исследуемой воды и получают разведение 1:10. После тщательного встряхивания 1 мл воды из этой пробирки переносят во вторую (разведение 1:100), из которой – в третью и т.д.
Для приготовления каждого разбавления пользуются отдельной стерильной пипеткой. Чем более загрязнена вода, тем больше готовят разведений. Затем в стерильные чашки Петри, слегка приподнимая их крышки, вносят по 1 мл из каждого разведения.
При заведомо чистой воде (артезианской, водопроводной) засевают в 2 чашки по 0,5-1 мл неразведенной воды или прибегают к центрифугированию. Для этого берут 15-20 мл воды, центрифугируют при частоте вращения 1500 мин в течение 10-15 мин. Верхний слой жидкости отсасывают, оставив в пробирке около 5 мл. Осадок этот, встряхивая, распределяют во всем объеме жидкости и разливают стерильной градуированной пипеткой в стерильные чашки Петри по 0,1-0,2-0,3 и 0,5 мл.
После этого в чашки Петри наливают 10-12 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С мясопептонного или суслового агара. Чашки закрывают, смешивают агар с водой и оставляют на столе до застывания агара. Посевы защищают от действия солнечных лучей, закрывая чашки бумагой. На крышках отмечают номера или название пробы и разведение, а также дату посева. Одну чашку помещают вверх дном в термостат при температуре 37 °С, а другую – в термостат, где температура 20-22°С, так как в воде могут быть микробы, для которых различна оптимальная температура роста.
|
|
|
По истечении 24 ч роста при температуре 37 °С и 48 ч при температуре 20 °С подсчитывают число выросших колоний в глубине и на поверхности агара. Если колоний выросло немного или много мелких колоний, то считают с помощью лупы, повернув чашку вверх дном, отмечая при этом каждую сосчитанную колонию чернилами или карандашом по стеклу. Если выросло большое количество колоний, то дно чашки делят на секторы и подсчет ведут в каждом отдельном секторе.
При очень большом количестве выросших колоний пользуются специальной счетной камерой, которая представляет собой стеклянную пластинку, разделенную на 144 квадрата, площадь каждого из которых равна 1 см2. Квадраты, расположенные по диагонали, в свою очередь, делят на 9 малых квадратов каждый. Пластинка крепится на деревянной подставке.
Общее количество колоний, выросших на чашке Петри, подсчитывают следующим образом. Определив площадь, чашку с выросшими колониями помещают на черное стекло или бумагу вверх дном и покрывают счетной пластиной. Подсчитывают число колоний в 10 квадратах, взятых в разных местах чашки, затем выводят среднее арифметическое для одного квадрата и умножают на площадь чашки.
|
|
|
Если на чашке выросло 50 колоний, а посев был произведен из 0,1 мл воды, то в 1 мл исследуемой воды в данном примере было 500 микробных клеток (считая, что каждая колония выросла из одной микробной клетки). Если после центрифугирования из 20 мл оставили 5 мл воды, то в 1 мл воды нужно считать 125 микробных клеток. В том случае, когда воду предварительно разводили, полученное число умножают на степень разведения воды. При наличии в 1 мл воды от 0 до 100 колоний микробов вода считается чистой, от 100 до 1000 колоний – сомнительной, от 1000 и более колоний - непригодной для бытового использования.
Определение Coli-титра и Coli-индекса воды.
Наибольшую опасность представляет фекальное загрязнение воды, так как вместе с фекалиями в воду могут попасть патогенные микробы. Обнаружить микробы в воде трудно ввиду их небольшой концентрации, поэтому в таких случаях прибегают к косвенным показателям. Основным показателем фекального загрязнения является кишечная палочка Escherichia co l i – постоянный обитатель кишечника людей и животных. Escherichia co li сохраняется в воде довольно продолжительное время и легко обнаруживается.
|
|
|
Степень загрязнения воды определяется Coli-титром или Coli-индексом. Coli-титр показывает наименьшее количество воды, в котором при посеве обнаруживается, хотя бы одна кишечная палочка; Coli-индекс – число кишечных палочек в 1 л воды. Для перевода Coli-титра в Coli-индекс 1000 делят на показатель Coli-титра. Для перевода Coli-индекса в Coli-титр 1000 делят на число, выражающее Coli-индекс.
Для определения Coli-титра пользуются методами бродильных проб и мембранных фильтров. Они основаны на том, что кишечная палочка размножается при температуре 43-45 °С, в то время как рост большинства водных бактерий при этой температуре задерживается. Во время роста кишечная палочка сбраживает разные углеводы в питательных средах. При определении Coli-титра берут разные объемы засеваемой воды (в зависимости от источника водоснабжения). Водопроводную воду засевают в количестве 300 мл (два объема по 100 мл и десять объемов по 10 мл)/
При засеве воды открытых водоемов взятый объем зависит от степени предполагаемого загрязнения. При средней загрязненности водоема для посева берут 100 мл (первый объем), 10 мл (второй объем), 1 мл (третий объем) и 0,1 мл (четвертый объем). Из загрязненных водоемов - соответственно 1; 0,1; 0,01 и 0,001 мл. Засевают на среду Булижа с поплавками. Соотношение среды и засеваемой воды 1: 2. Малые количества воды засевают на неконцентрированную среду Булижа в пробирках. Посевы выращивают в термостатах при температуре 43 °С в течение 24-48 ч. Затем отмечают изменение цвета среды, наличие или отсутствие газа и мути. Если среда не изменилась, кишечная палочка в пробе отсутствует, исследование прекращают.
|
|
|
Из пробирок с мутью, газом и тех, где среда Булижа имеет соломенно-желтый цвет, производят посев на среду Эндо. Выращивают микроорганизмы при температуре 37 °С и в течение 18-24 ч. При наличии красных с металлическим блеском или розовых, выпуклых слизистых колоний из них готовят мазки и красят по Граму для обнаружения коротких грамотрицательных палочек. Если таковые обнаружены, производят вторичный посев из подозрительных колоний со среды Эндо на среду Булижа, разведенную в отношении 1:10 и разлитую по 5 мл в пробирки.
Посевы выращивают в термостате в течение суток при температуре 37 °С. После этого, дают заключение о степени загрязненности воды кишечной палочкой. Данные анализов, выраженные в виде Coli-титра и Coli-индекса сравнивают с данными таблиц 2 и 3.
Таблица 2 – Результаты анализов
| Количество объемов по 10 мл | Количество объемов колодезной и водопроводной по 100 мл | |||||
| 1 | 2 | 3 | ||||
| Coli-титр, более | Coli-индекс, менее | Coli-титр | Coli-индекс | Coli-титр | Coli-индекс | |
| 0 | 333 | 3 | 250 | 4 | 91 | 11 |
| 1 | 333 | 3 | 125 | 8 | 56 | 18 |
| 2 | 143 | 7 | 77 | 13 | 37 | 27 |
| 3 | 91 | 11 | 57 | 18 | 26 | 38 |
| 4 | 71 | 14 | 42 | 24 | 19 | 52 |
| 5 | 56 | 18 | 33 | 30 | 14 | 70 |
| 6 | 45 | 22 | 28 | 36 | 11 | 92 |
| 7 | 37 | 27 | 23 | 43 | 120 | |
| 8 | 32 | 31 | 20 | 51 | 6 | 161 |
| 9 | 28 | 36 | 17 | 60 | 4 | 230 |
| 10 | 25 | 40 | 14 | 89 | менее 4 | более 230 |
Примечание. При второй бродильной пробе наблюдается газообразование и муть в 1 объеме (по 100 мл) и в 5 пробирках (по 10 мл). Находим по вертикали 1, по горизонтали 5 и на пересечении отмечаем значения; Coli-титр – 56 и Coli-индекс – 18.
Для определения Coli-индекса пользуются ускоренным методом с помощью мембранных ультрафильтров (кружков диаметром 3,5 см), которые выпускаются под пятью номерами. Чем больше размеры пор, чем выше его номер и быстрее идет фильтрация. Для санитарно-бактериологического исследования воды наиболее пригоден ультрафильтр № 3.
Таблица 3 – Количество воды для анализов
| Объем исследуемой воды открытых водоемов, рек, озер, мл | Coli-титр | Coli-индекс | |||
| 100 | 10 | 1,0 | 0,1 | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| - | - | - | - | Более 111 | Менее 9 |
| - | - | - | + | 111 | 9 |
| - | - | + | - | 111 | 9 |
| - | + | - | - | 105 | 9,5 |
| - | - | + | + | 56 | 18 |
| - | + | - | + | 53 | 19 |
| - | + | - | + | 46 | 22 |
| + | - | - | - | 43 | 23 |
| - | + | + | + | 36 | 28 |
| + | - | - | + | 11 | 92 |
| + | - | + | - | 10 | 94 |
| + | - | + | + | 6 | 180 |
| + | + | - | - | 4 | 230 |
| + | + | - | + | 1 | 960 |
| + | + | + | - | 0,4 | 2380 |
| + | + | + | + | менее 0,4 | более 2380 |
Примечания: 1.«+» кишечная палочка выделена; «-» – не выделена. Воду для питьевых и хозяйственных нужд можно использовать при следующих показателях: общее количество микробов должно быть не более 100 в 1 мл; Coli-титр – не менее 333, Coli-индекс – 3; 2. Вода из артезианских скважин, поступающая в водопроводную систему без очистки и дезинфекции, должна иметь Coli-титр не менее 500, Coli-индекс – не более 2. Воду открытых водоемов можно считать доброкачественной при Coli-титре не менее 111 и Coli-индексе – 9.
Матовая сторона ультрафильтра называется воздушной. При фильтрации и засеве матовая сторона должна быть обращена вверх, а обратная (блестящая) – вниз, соприкасаясь с питательной средой. Через мембранные ультрафильтры, используя приборы Рублевского или Зейтца, фильтруют соответствующий объем воды.
Перед фильтрованием мембранные фильтры кипятят 10-15 мин в дистиллированной воде, медленно нагревая и не допуская бурного кипения. Фильтровальный прибор стерилизуют обжиганием, автоклавированием или кипячением. Аппарат охлаждают, на сетку помещают стерилизованный кружок фильтровальной бумаги, смоченный стерильной водой, а затем стерильный ультрафильтр (бумагу используют для предохранения ультрафильтра от повреждения).
По окончании фильтрования стерильным пинцетом накладывают мембранные фильтры в чашки на среду Эндо. После суточного роста в термостате при температуре 43 °С из характерных для кишечной палочки колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют и засевают в пробирки с глюкозопептонной водой или средой Булижа с поплавком. Выдерживают посевы при 43 °С в течение суток. Характерный рост является доказательством наличия кишечной палочки. Морфологические и культуральные свойства кишечной группы бактерий определяются стандартным способом.
Вопросы для обсуждения.
1 Какие данные необходимо указывать в сопроводительном документе к пробам воды?
2 Назовите допустимые показатели содержания в воде Со1i-титра и Со1i-индекса.
3 Почему сроки исследования проб воды ограничены 2-6 часами?
4 При какой температуре необходимо культивировать Escherichia co l i и с чем это связано?
5 Как связаны между собой показатели Со1i-титра и Со1i-индекса?
6 Чем определяется выбор объема засеваемой воды, взятый из различных источников?
7 Почему определение Со1i-титра и Со1i-индекса так широко используется при проведении бактериологического анализа воды? Является ли наличие Escherichia co l i объективным показателем биологического загрязнения воды?
Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 402; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!