Работа 53. Определение содержания общих фосфолипидов
В сыворотке крови
Метод основан на определении концентрации органического фосфата, освободившегося при кислотном гидролизе. Измерение содержания неорганического фосфата проводится реакцией с молибдатом аммония, принцип которой см. работу 11.
Реактивы. Трихлоруксусная кислота, 0,6 М раствор; реактив молибдата аммония*; хлорная кислота, конц.; восстанавливающий реактив*.
Оборудование. Фильтровальная бумага; центрифуга с центрифужными весами; штатив с пробирками; пипетки для забора концентрированных кислот; пипетки вместимостью 0,1; 1 и 5 мл; песчаная баня; ФЭК.
Материал. Сыворотка крови.
Ход определения. В опытную пробирку вносят 0,2 мл сыворотки и 2,8 мл дистиллированной воды, в контрольную – 3 мл дистиллированной воды. Добавляют в обе пробирки по 3 мл раствора трихлоруксусной кислоты и встряхивают для перемешивания содержимого.
Центрифугируют опытную пробу 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, пробирку переворачивают на фильтровальную бумагу до полного стекания жидкости. Затем в обе пробирки приливают по 1 мл концентрированной хлорной кислоты (специальной пипеткой, осторожно!), помещают в каждую из них по две стеклянные бусинки и встряхивают их содержимое. Пробы ставят на гидролиз в песчаную баню при 180˚С на 20-30 мин (до обесцвечивания раствора).
Пробирки охлаждают на воздухе до комнатной температуры, прибавляют по 3 мл дистиллированной воды, по 1 мл реактива молибдата аммония и по 1 мл свежеприготовленного восстанавливающего реактива. Тщательно перемешивают содержимое пробирок и оставляют на 10 мин при комнатной температуре.
|
|
Фотометрируют опытную пробу против контрольной на ФЭКе при 630 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.
Расчет. Содержание общих фосфолипидов х (г/л) в сыворотке крови рассчитывают по формуле
m5000∙25
х = —————— ,
10
где m – масса неорганического фосфата в пробе, найденная по калибровочному графику (рис. 8), мг;
5000 – коэффициент пересчета на литр сыворотки крови;
10 – коэффициент пересчета миллиграммов в граммы;
25 – коэффициент пересчета (липидный фосфор составляет 4% относительной молекулярной массы фосфолипидов).
Для пересчета липидного фосфора на ммоль/л необходимо полученные результаты умножить на коэффициент 0,323.
Оформление работы. По полученному значению экстинкции рассчитать содержание общих фосфолипидов и липидного фосфора в сыворотке крови. Сделать вывод относительно полученных данных.
Практическое значение работы. Фосфолипиды сыворотки (плазмы) крови входят в состав липопротеидов, обусловливая вместе с белком полярные свойства этих смешанных макромолекул и их растворимость. В норме содержание общих фосфолипидов составляет 1,5-3,6 г/л, или 2,0-3,5 ммоль/л липидного фосфора. Важным показателем является индекс фосфолипиды/холестерин, который в физиологических условиях равен 1-1,5. Этот индекс снижается при атеросклерозе, гипертонической болезни, заболеваниях печени. Повышение концентрации фосфолипидов в сыворотке крови (гиперфосфолипидемия) наблюдается при сахарном диабете, гипотиреозе, при поражении почек и т.д. Пониженный уровень их встречается при тяжелых формах острого гепатита, жировом перерождении печени, тиреотоксикозе.
|
|
Работа 54. Разделение липидов сыворотки крови
методом тонкослойной хроматографии
Метод основан на различной скорости перемещения липидных фракций сыворотки крови (фосфолипиды, свободные жирные кислоты, холестерин, глицериды) в тонком слое адсорбента при движении через него органического растворителя. Скорость разделения фракций зависит от их относительной полярности, и для их обнаружения полученные хроматограммы обрабатывают парами иода.
Реактивы. Этанол – диэтиловый эфир (3:1); хлороформ; растворитель для хроматографии: н-гексан – диэтиловый эфир – уксусная кислота (73:25:2); иод металлический.
|
|
Оборудование. Пластинки хроматографические Силуфол УФ254; камера для хроматографии; водяная баня; камера для проявления хроматограмм; хроматоскоп.
Материал. Сыворотка крови.
Ход определения. В мерной колбе вместимостью 25 мл смешивают 1 мл исследуемой сыворотки крови с 10 мл приготовленной спирто-эфирной смеси. Колбу с содержимым помещают на 30 с в кипящую водяную баню, охлаждают под струей холодной воды и доводят объем спирто-эфирной смесью до 25 мл. Полученный липидный экстракт отфильтровывают через обезжиренный бумажный фильтр в широкогорлую пробирку, выпаривают досуха в кипящей водяной бане, а осадок растворяют в 0,2 мл хлороформа.
В хроматографическую камеру наливают 2-3 мл растворителя. Пастеровской пипеткой наносят на хроматографическую пластину, отступя 1 см от края, 0,01-0,02 мл хлороформного экстракта, помещают пластину в камеру этим концом вниз, погрузив его на 3-5 мм в растворитель. Камеру закрывают крышкой для поддержания равномерной концентрации паров. Хроматографию проводят при комнатной температуре до тех пор, пока фронт растворителя не приблизится к верхнему краю, не доходя до него 0,5 см.
|
|
Полученную хроматограмму извлекают из камеры, высушивают на воздухе и вносят в камеру для проявления, на дно которой предварительно насыпают кристаллы металлического иода. Сосуд закрывают и подогревают в водяной бане при 60˚С. Возгоняющийся иод вступает в реакцию с липидными фракциями.
Через 1 мин хроматограмму извлекают и просматривают в ультрафиолетовом свете на хроматоскопе. Фракции липидов обнаруживают в виде коричневых пятен. Ближе к линии старта расположены фосфолипиды, затем неидентифицированные соединения, холестерин, моноглицериды, свободные жирные кислоты, триглицериды и эфиры холестерина.
Оформление работы. Зарисовать полученную хроматограмму, указав на ней соответствующие липидные фракции сыворотки крови. Указать в выводах возможность дальнейшего количественного определения липидных компонентов.
ОБМЕН БЕЛКОВ И АМИНОКИСЛОТ
В обмене белков можно условно выделить два этапа: первый – распад белков (в том числе апопротеинов сложных белков) до аминокислот и второй – превращение аминокислот до конечных продуктов метаболизма (мочевина, СО2 и Н2О) или до некоторых азотсодержащих производных (биогенные амины, креатин, порфирины и т.д.). Для оценки состояния белкового обмена организма исследуют содержание белков и отдельных их фракций в сыворотке крови, аминокислот, а также активность ферментов, катализирующих отдельные стадии превращения белков и аминокислот.
Работа 55. Определение содержания белковых фракций
сыворотки крови турбидиметрическим методом
Реактивы. Основной фосфатный буферный раствор и его рабочие растворы № 1-4*.
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1; 2,5 и 10 мл; палочки стеклянные; ФЭК.
Материал. Сыворотка крови.
Метод основан на способности отдельных белковых фракций сыворотки крови осаждаться в виде мелкой взвеси в фосфатных растворах определенной концентрации. Степень мутности раствора пропорциональна содержанию белковых фракций.
Ход определения. Нумеруют шесть пробирок: 0, 1, 2, 3, 4, 5 и ставят их в штатив. В пробирку «0» (контрольная) вносят 5 мл дистиллированной воды, а в пробирки 1-4 по 5 мл соответствующих рабочих буферных растворов.
В пробирку № 5 наливают 0,5 мл сыворотки крови, 0,75 мл дистиллированной воды и 3,75 мл основного раствора фосфатного буфера, содержимое тщательно перемешивают.
Из пробирки № 5 переносят 0,5 мл в контрольную пробирку и по 0,5 мл в пробирки № 1-4, после чего содержимое их перемешивают стеклянной палочкой.
Через 15 мин определяют степень мутности (экстинкцию) растворов № 1-4 против контрольной (нулевая проба) на ФЭКе при 610-640 нм (светофильтр красный) в кювете с толщиной слоя 1 см (перед фотометрией пробирки встряхивают).
Расчет. Подобранные концентрации растворов фосфатного буфера позволяют осаждать разные фракции белков в зависимости от их изоэлектрической точки. В пробирке № 1 осаждаются все фракции; № 2 – все фракции глобулинов; № 3 –β- и γ-глобулины и № 4 – только γ-глобулины. Исходя из этого, рассчитывают содержание отдельных белковых фракций в процентах или в абсолютных величинах (в г/л).
В процентах расчет проводят следующим образом. Вычисляют Е для каждой фракции:
для альбуминов Е = Е1 – Е2;
для α-глобулинов Е = Е2 – Е3;
для β-глобулинов Е = Е3 – Е4;
для γ-глобулинов Е = Е4
Полученные значения Е для каждой белковой фракции складывают и условно принимают за 100%, после чего находят содержание для каждой фракции х (в %) по формуле
Еоп 100%
х = ————— ,
Еобщ
где Еоп – экстинкция данной фракции,
Еобщ – сумма экстинкций всех фракций.
Для расчета содержания белковых фракций в абсолютных значениях предварительно определяют концентрацию белка в сыворотке крови биуретовым методом (см. работу 8) и затем делают расчеты по формуле
Еоп С
х = ————— ,
Еобщ
где х – содержание данной фракции, г/л;
С – концентрация белка в сыворотке крови, определенная биуретовым методом, г/л.
Оформление работы. Рассчитать процентное и абсолютное содержание белковых фракций в сыворотке крови (для расчета в абсолютных единицах можно использовать данные содержания белка в сыворотке крови, полученные в работе 8), а также альбумин/глобулиновый индекс и сделать вывод.
Практическое значение работы. В норме содержание белковых фракций в сыворотке крови следующее: альбумины 35-60 г/л и глобулины 25-35 г/л, из них α1-глобулины 2,5-5%, α2-глобулины 7-13%, β-глобулины 8-14% и γ-глобулины 12-22%. В абсолютных единицах концентрация α1-глобулинов равна 2,0-5,0, α2-глобулинов 4,0-7,0, β-глобулинов 5,0-9,0 и γ-глобулинов 8,0-17,0 г/л. Индекс альбумины/глобулины колеблется от 1,5 до 2,3. При различных патологических состояниях происходит изменение протеинограммы. Острый воспалительный процесс характеризуется уменьшением содержания альбуминов и возрастанием содержания α-глобулинов, а в более поздние сроки – увеличением концентрации γ-глобулинов. Для хронического воспаления более типично выраженное повышение уровня α2 и γ-глобулинов и умеренное снижение альбуминов в сыворотке крови; при злокачественных новообразованиях резко снижается содержание альбуминов с одновременным существенным увеличением всех глобулиновых фракций. Поражения печени (гепатиты, цирроз печени) сопровождаются снижением альбуминов, которые образуются в печеночной ткани, и относительным увеличением γ-глобулинов.
Работа 56. Определение активности катепсинов в сыворотке крови
по А.А.Покровскому, А.И.Арчакову и О.Н.Любимцевой
Реактивы. Ацетатный буфер, 0,1 М раствор с рН 4,0; гемоглобин, 4%-ный раствор на ацетатном буфере с рН 4,0*; трихлоруксусная кислота, 8%-ный раствор.
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; центрифуга с центрифужными весами; спектрофотометр.
Материал. Сыворотка крови.
Метод основан на спектрофотометрическом определении при 280 нм кислоторастворимых продуктов гидролиза гемоглобина, образующихся под действием катепсинов сыворотки крови.
Реакция протекает по уравнению
Катепсины
Глобин ——————— (n + 1) Фрагменты глобина
+ nН2О
Экстинкцию кислоторастворимых продуктов гидролиза глобина (пептиды, свободные аминокислоты) измеряют при 280 нм на спектрофотометре. В этой области спектра в основном поглощает тирозин и в меньшей степени триптофан и фенилаланин.
Ход определения. В опытную пробирку вносят 1 мл раствора гемоглобина и 0,5 мл сыворотки крови, а в контрольную – те же вещества в том же объеме и 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Пробы перемешивают встряхиванием.
Ставят пробирки на 60 мин в водяную баню при 37˚С, после этого приливают к опытной пробе 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают содержимое встряхиванием. Центрифугируют пробы 10 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки.
Измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на спектрофотометре при 280 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.
Расчет. Проводят с использованием калибровочного графика на тирозин или молярного коэффициента экстинкции тирозина:
Е5000
х = —————— ,
0,436
где х – активность катепсинов, ммоль тирозина/(ч∙л);
Е – экстинкция опытной пробы против контрольной;
5000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;
0,436 – коэффициент экстинкции 1 ммоля тирозина.
Оформление работы. По экстинкции рассчитать активность катепсинов в сыворотке крови, сделать вывод и отметить практическое значение определения данного фермента.
Практическое значение работы. Катепсины, гидролизующие белки в кислой зоне рН, специфичны для лизосом тканей, поэтому в научных исследованиях их определяют как индикаторы чистоты лизосомальной фракции. При поражении органов, особенно при некрозах, активность катепсинов в сыворотке крови увеличивается. Это явление отмечено при инфаркте миокарда, причем степень повышения ферментативной активности в сыворотке крови зависит от глубины и распространенности некротического очага в сердце.
Работа 57. Определение активности аспартат- и аланин-
аминотрансферазы в сыворотке крови по Райтману и Френкелю
Реактивы. Субстратные растворы № 1 и № 2*; 2,4-динитрофенилгидразин, 0,1%-ный раствор на 2 М растворе соляной кислоты; гидроксид натрия, 0,4 М раствор.
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,2; 1 и 5 мл; водяная баня; ФЭК.
Материал. Сыворотка крови.
Метод основан на определении пировиноградной кислоты, которая является одним из продуктов реакции, катализируемой аланинаминотрансферазой, или продуктом декарбоксилирования оксалацетата, образующегося в реакции, катализируемой аспартатаминотрансферазой. Образовавшаяся пировиноградная кислота определяется по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (см. работу 31).
Ход определения. Определение активности ферментов проводят по схеме
Последовательность операций | АлАТ | АсАТ | ||
опыт | контроль | опыт | контроль | |
Внесение субстратных растворов | Раствор № 1 – 0,5мл | Раствор № 1 – 0,5мл | Раствор № 2 – 0,5мл | Раствор № 2 – 0,5мл |
Нагревание | 5 мин при 37˚С | 5 мин при 37˚С | ||
Добавление 2,4-ДНФГ | - | 1,0 мл | - | 1,0 мл |
Добавление сыворотки | 0,1 мл | 0,1 мл | 0,1 мл | 0,1 мл |
Инкубация | 30 мин при 37˚С | 60 мин при 37˚С | ||
Добавление 2,4-ДНФГ | 0,5 мл | - | 0,5 мл | - |
Экспозиция | 20 мин при 18-20˚С | 20 мин при 18-20˚С | ||
Добавление гидроксида натрия | 5,0 мл | 5,0 мл | 5,0 мл | 5,0 мл |
Экспозиция | 10 мин при 18-20˚С | 10 мин при 18-20˚С |
Фотометрируют опытные пробы против контрольной на ФЭКе при 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см.
Расчет производят по формулам:
m10000 m10000∙2
х(АсАТ) = ———— или х(АлАТ) = ———— ,
1000 1000
где х – активность ферментов, ммоль/(ч∙л);
m – количество пировиноградной кислоты в пробе, найденное по калибровочному графику (рис. 9), мкмоль;
10000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки;
1000 – коэффициент пересчета мкмоль в ммоль;
2 – для пересчета на 1 ч.
Практическое значение работы. В норме активность аланинаминотрансферазы составляет 0,1-0,68, а аспартатаминотрансферазы 0,1-0,45 ммоль/(ч∙л).
Определение активности АсАТ и АлАТ и их отношения широко используется в клинической практике для выявления патологических процессов в различных органах. В миокарде более высокая активность АсАТ, чем АлАТ, в печени обратное соотношение активности этих ферментов. При инфаркте миокарда значительно увеличивается активность АсАТ в сыворотке крови с одновременным повышением коэффициента АсАТ/АлАТ. При поражении печени (цирроз, сывороточный гепатит и т.д.) более выраженно повышается активность АлАТ и снижается коэффициент АсАТ/АлАТ.
Работа 58. Определение активности гистидазы в сыворотке крови
по Табору и Мелеру в модификации В.А.Буробина
Реактивы. L-гистидина моногидрохлорид, 0,2 М раствор (418 мг в 100 мл), доведенный с помощью 1 М раствора NaOH до рН 8,2; пирофосфатный буфер, 0,1 М раствор с рН 8,2*; трихлоруксусная кислота, 20%-ный раствор; активирующий раствор, содержащий восстановленный глутатион и альбумин*; уроканиновая кислота, 0,001 М раствор для построения калибровочного графика (8,7 мг дигидрата уроканиновой кислоты растворяют в 0,001 М растворе NaOH в мерной колбе вместимостью 50 мл).
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; водяная баня с лабораторным термометром; термостат, отрегулированный на 37˚С; центрифуга с центрифужными весами; спектрофотометр.
Материал. Сыворотка крови.
Метод основан на измерении экстинкции уроканиновой кислоты, образующейся из гистидина под действием гистидазы, в зоне ее максимального поглощения при 264 нм в кислой среде.
Ферментативная реакция протекает по уравнению
Ход работы. В две пробирки – контрольную и опытную – вносят по 0,3 мл пирофосфатного буфера, по 0,5 мл исследуемой сыворотки и по 1 мл активирующего раствора. В опытную пробирку приливают 1 мл раствора гистидина и доводят объем пробы до 3 мл дистиллированной водой. Перемешивают содержимое встряхиванием.
Обе пробирки помещают на 2 ч в водяную баню или термостат при 37˚С, затем добавляют в пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. После этого в контрольную пробу приливают 1 мл активирующего раствора, объем ее доводят до 3 мл дистиллированной водой и перемешивают содержимое встряхиванием.
Пробы центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин, после чего надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки.
Измеряют экстинкцию опытной работы против контрольной на спектрофотометре при 264 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.
Для построения калибровочного графика в семь пронумерованных пробирок вносят компоненты, перечисленные в приведенной ниже таблице, в указанных количествах.
Для приготовления рабочего раствора уроканиновой кислоты берут ее исходный 0,001 М раствор и разбавляют в 10 раз дистиллированной водой.
Доводят объем всех проб до 3 мл дистиллированной водой, добавляют во все пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают содержимое. Центрифугируют пробы 5 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки и измеряют экстинкцию, как указано выше.
№№ пробы | Рабочий раствор уроканиновой кислоты, мл | Пирофосфатный буфер, мл | Активирующий раствор, мл | Раствор гистидина, мл | Содержание уроканиновой кислоты в пробе, мкмоль |
1 | 0 | 0,3 | 1,0 | 1,0 | 0 |
2 | 0,05 | 0,3 | 1,0 | 1,0 | 0,005 |
3 | 0,10 | 0,3 | 1,0 | 1,0 | 0,010 |
4 | 0,15 | 0,3 | 1,0 | 1,0 | 0,015 |
5 | 0,20 | 0,3 | 1,0 | 1,0 | 0,020 |
6 | 0,30 | 0,3 | 1,0 | 1,0 | 0,030 |
7 | 0,40 | 0,3 | 1,0 | 1,0 | 0,040 |
Расчет производят по формуле
Е200
х = ————— ,
2
где х – активность гистидазы в сыворотке крови, мкмоль/(ч∙л);
Е – содержание уроканиновой кислоты в пробе, найденное по калибровочному графику, мкмоль;
200 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;
2 – коэффициент пересчета на 1 ч.
Оформление работы. По полученным экстинкциям рассчитать активность гистидазы в сыворотке крови, сравнить ее с нормой и указать причины возможных отклонений.
Практическое значение работы. Гистидаза содержится преимущественно в печени и коже человека и относится к органоспецифичным для них ферментам. При поражении этих органов, главным образом печени, наблюдается поступление этого фермента в кровь. В норме активность гистидазы в сыворотке крови определяется в виде следов примерно у 1-2% здоровых пациентов. Лишь у грудных здоровых детей регистрируется активность этого фермента в сыворотке крови. При заболеваниях печени в сыворотке крови выявляется гистидазная активность, причем степень ее увеличения характеризует тяжесть патологического процесса.
Работа 59. Определение содержания свободного гидроксипролина
в моче по Нейману и Логану в модификации П.Н.Шараева
Реактивы. Сульфат меди (II), 0,01 М раствор; пероксид водорода, 6%-ный раствор; серная кислота, 6 М раствор; реактив Эрлиха (5%-ный раствор n-диметиламинобензальдегида в н-пропаноле или изопропаноле); гидроксид натрия, 2,5 М раствор.
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 мл; стеклянные палочки; термостат; вода со льдом (или снегом) в стакане; водяная баня; ФЭК.
Материал. Моча, предварительно профильтрованная.
Метод основан на взаимодействии продукта окисления и декарбоксилирования гидроксипролина с n-диметиламинобензальдегидом, в результате чего образуется окрашенное соединение розового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации гидроксипролина в пробе.
Ход работы. В две пробирки вносят по 1 мл профильтрованной мочи, раствора сульфата меди (II), раствора гидроксида натрия и раствора пероксида водорода. Содержимое обеих пробирок перемешивают стеклянной палочкой в течение 5 мин, затем их ставят в термостат при 70˚С на 5 мин, периодически встряхивая до полного прекращения выделения пузырьков. Затем пробы охлаждают в воде со льдом или снегом. К охлажденным пробам приливают по 4 мл раствора серной кислоты и по 2 мл реактива Эрлиха и перемешивают содержимое пробирок стеклянной палочкой. После этого опытную пробирку помещают в кипящую водяную баню на 80 с, а контрольную – на то же время в воду со льдом или снегом.
Измеряют экстинкцию опытной и контрольной проб против воды на ФЭКе при зеленом светофильтре в кювете с толщиной слоя 1 см. Из экстинкции опытной пробы вычитают экстинкцию контрольной пробы и полученную величину используют для нахождения содержания гидроксипролина в пробе по калибровочному графику.
Для построения калибровочного графика отмеривают в одну пробирку 1 мл воды («слепая» проба), а в пять других (стандартные пробы) – по 1 мл раствора гидроксипролина с концентрацией его 1, 10, 15, 20 и 25 мкг/мл.
Далее пробы обрабатывают так же, как и описанные выше опытные, измеряют экстинкцию стандартных проб против «слепой» при тех же условиях.
Расчет производят по формуле
ЕV
х = ————— ,
1000
где х – содержание гидроксипролина в моче, мг/сут;
Е – содержание гидроксипролина в пробе, найденное по калибровочному графику по разнице экстинкций опытной и контрольной проб, мкг;
V – суточный объем мочи, мл;
1000 – коэффициент пересчета микрограммов в миллиграмы.
Практическое значение работы. Гидроксипролин входит в состав только белков соединительной ткани – коллагена и эластина, в которых содержание данной аминокислоты составляет соответственно 10-15 и 1,5%. Выделение гидроксипролина с мочой, а также концентрация его в плазме или сыворотке крови зависит, в основном, от скорости синтеза коллагена, образования коллагеновых фибрилл и интенсивности распада коллагена в тканях.
В норме экскреция свободного гидроксипролина с мочой у взрослого человека составляет 1-8 мг, или 7,6-61,0 мкмоль в сутки. Повышенное выделение его с мочой отмечается при повреждении соединительной ткани, сопровождающемся распадом коллагена (например, при ревматизме, системной склеродермии, поражении костей и др.). Динамическое наблюдение за экскрецией гидроксипролина с мочой может дать информацию о формировании рубца в постинфарктном очаге миокарда.
Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 421; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!