Построение калибровочного графика
В ряд пробирок (см. приложение) разливают калибровочный раствор диоксиацетона, доливают водой и далее проводят реакцию также, как и при определении активности фермента.
| № пробирки | Калибровочный раствор диоксиацетона, мл | Дистил. вода, мл | Диоксиацетон в пробе, мкмоль | Фруктозо-1,6-бис-фосфат в пробе, мкмоль |
| 1 | 0,05 | 0,45 | 0,5 | 0,25 |
| 2 | 0,10 | 0,40 | 1,0 | 0,50 |
| 3 | 0,20 | 0,30 | 2,0 | 1,0 |
| 4 | 0,30 | 0,20 | 3,0 | 1,5 |
| 5 | 0,40 | 0,10 | 4,0 | 2,0 |
Оформление работы. После определения активности фермента по полученным данным сделать вывод о возможных изменениях активности фермента и причинах этих отклонений.
Практическое значение работы. В норме активность фруктозо-1,6-бис-фосфатальдолазы составляет 3,6-21,8 мкмоль/ч∙л. Повышение активности фермента наблюдается при заболеваниях печени, поражении ее гепатотропными ядами, а также в случае нарушений со стороны сердечной и скелетной мышц (инфаркт миокарда, прогрессирующая мышечная дистрофия, миозит и т.д.).
Работа 23. Определение глюкозофосфат-изомеразы
(D-глюкозо-6-фосфат кетол-изомераза; КФ 5.3.1.9)
В сыворотке крови
Реактивы. Субстратная смесь для выявления глюкозофосфат-изомеразы*, трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; резорцин, 0,1%-ный раствор в 3,6%-ной соляной кислоте; соляная кислота, 36%-ный раствор.
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; водяная баня; лабораторный термометр.
|
|
|
Материал. Сыворотка крови.
Метод основан на определении фруктозо-6-фосфата, образующегося в ходе изомеризации глюкозо-6-фосфата под действием глюкозофосфат-изомеразы:
 |
Фруктозо-6-фосфат образует с резорцином в присутствии соляной кислоты соединение красного цвета.
Ход определения. В две пробирки вносят по 0,5 мл сыворотки крови. В одну из них (опытную) добавляют 1 мл субстратной смеси и перемешивают. Помещают обе пробирки на 30 мин в водяную баню при 37˚С, а по окончании инкубации в них приливают по 1,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты (для остановки реакции). В контрольную пробу доливают 1 мл субстратной смеси.
После перемешивания содержимое каждой пробирки фильтруют через складчатый бумажный фильтр. Отбирают по 1 мл фильтрата в чистые пробирки, приливают по 1 мл резорцина и по 3 мл раствора соляной кислоты. Смеси энергично встряхивают и оставляют для развития окраски. Отмечают разницу окрашивания в пробах.
Оформление работы. Отметить различие окраски проб и сделать вывод о присутствии фермента в сыворотке крови.
Изучение кинетических свойств ферментов
Кинетика ферментативных реакций – это раздел энзимологии, который изучает зависимость скорости реакций, катализируемых ферментами, от химической природы реагирующих веществ (т.е. субстратов и ферментов) и от условий их взаимодействия, т.е. от температуры, концентрации компонентов, рН среды, состава среды, присутствия модификаторов и т.д. Изучение кинетики ферментативных реакций показывает не только их отличия от небиологических катализаторов, обусловленные прежде всего белковой природой ферментов, но и многообразие условий, от которых зависит правильное определение активности любого фермента.
|
|
|
Скорость реакции, т.е. убыль субстрата или прирост количества продукта за определенные промежутки времени, является мерой каталитической активности фермента или просто активностью фермента.
Использование методов качественного анализа субстратов и продуктов реакции позволяет выявить присутствие фермента в биологическом материале, а количественное определение их дает возможность определить содержание фермента или его активность в расчете на единицу массы или объема исследуемого образца.
Работа 24. Кинетика ферментативных реакций
на примере α-амилазы слюны
|
|
|
Реактивы. Крахмал, 1%-ный раствор, свежеприготовленный; раствор иода в иодиде калия*; фосфатно-цитратный буфер, 0,1 М с рН 5,6; 6,4; 6,8; 7,2 и 8,0*.
Оборудование. Штатив с пробирками; водяная баня; лабораторный термометр; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; бюретка вместимостью 25 мл; химические стаканы (для льда или снега).
Материал. Слюна разбавленная (см. работу 18).
а. Зависимость скорости реакции от количества фермента. Метод основан на определении скорости гидролиза крахмала, выявляемого пробой с иодом, в зависимости от количества добавленной α-амилазы слюны.
Ход определения. Разводят исходную разбавленную слюну водой в пробирках в 20, 40, 80 и 160 раз. Берут четыре пробирки и вносят в каждую 1 мл одного из полученных разведений слюны. В пробирки из бюретки добавляют по 4 мл раствора крахмала, быстро помещают их в водяную баню при 38˚С и засекают время начала реакции.
Через каждые 1-2 мин отбирают по 2 капли жидкости из каждой пробы и приливают к ним по 1 капле раствора иода в иодиде калия. Вначале пробы дают синее, затем красно-фиолетовое и, наконец, красное окрашивание.
Отмечают с точностью до 0,5 мин время от начала опыта до появления в каждой из четырех пробирок красного окрашивания – стадия образования эритродекстринов из крахмала.
|
|
|
Оформление работы. Результаты изобразить графически, откладывая по оси ординат v – скорость реакции (величина, обратная времени образования эритродекстринов), а по оси абсцисс [C] – относительную концентрацию амилазы (разведение). Сделать вывод о зависимости скорости реакции от концентрации фермента и сравнить с той же зависимостью для небиологических катализаторов.
б. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры. Метод основан на определении скорости гидролиза α-амилазой слюны крахмала в зависимости от температуры.
Ход определения. В пробирку помещают 5 капель слюны, кипятят 1-2 мин на водяной бане и остужают. В две другие помещают по 5 капель некипяченой слюны.
Вносят во все пробы по 10 капель раствора крахмала и ставят первую и вторую пробирки в водяную баню при 38˚С, а третью – в воду со льдом или снегом на 3 мин. Затем прибавляют в каждую пробирку по 1 капле раствора иода в иодиде калия и сравнивают развивающуюся окраску.
Оформление работы. Данные оформляют в виде таблицы, делают вывод о зависимости ферментативной реакции от температуры и причинах этой зависимости.
| Фермент | Субстрат | Окрашивание с иодом | Температура |
в. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды. Метод основан на сравнении скорости гидролиза крахмала, определяемого пробой с иодом, под действием α-амилазы слюны при разных рН среды. В результате устанавливается оптимум рН действия α-амилазы.
Ход определения. В пять пробирок отмеривают по 10 капель растворов фосфатно-цитратного буфера со следующими значениями рН: 5,6; 6,4; 6,8; 7,2; 8,0. Прибавляют во все пробы по 5 капель разведенной в 10 раз слюны и по 10 капель раствора крахмала и ставят пробирки в водяную баню при 38˚С. Через 1-2 мин отбирают по 1 капле содержимого в другие пробирки и приливают по 1 капле раствора иода в иодиде калия. Отмечают время наступления красного окрашивания (стадия образования эритродекстринов) в каждой из пяти проб.
Оформление работы. Данные оформить графически, откладывая по оси абсцисс значения рН среды и по оси ординат – время (в мин), которое необходимо для гидролиза крахмала до стадии эритродекстринов. Сделать вывод об оптимуме рН действия α-амилазы слюны.
Практическое значение работы. Кинетические свойства ферментов изучаются для подбора оптимальных условий (концентрация субстрата, оптимум рН среды и температуры, ионный состав среды), определения активности ферментов в научных и клинических исследованиях, а также при стандартизации ферментных препаратов. Неверно подобранные стандартные условия определения конкретного фермента приводят к ошибкам в диагностике заболеваний и контроле качества ферментных препаратов.
Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 369; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!