Иммобилизация ферментов путём включения в структуру геля. Органические и неорганические гели. Методы включения в альгинатный и полиакриламидный гель
Методы контроля биомассы и количества клеток при культивировании.
В технологии получения биологически активных веществ (БАВ) микробиологическим синтезом можно выделить два основных этапа:
ферментация - процесс культивирования микроорганизма-продуцента в определенных условиях и образование целевого продукта;
выделение БАВ и его химическая очистка.
Первой стадией выделения и очистки БАВ является предварительная обработка и фильтрация культуральных жидкостей.
Эта стадия имеет важное значение, так как на этом участке отделяется большая часть примесей сопутствующих БАВ в культуральной жидкости и при этом наблюдаются большие потери целевого продукта (до 20%).
С точки зрения фильтрационных характеристик, культуральная жидкость представляет собой сложную многокомпонентную систему переменного состава.
По характеру дисперсий культуральные жидкости классифицируются следующим образом:
Культуральные жидкости, получаемые при культивировании низших грибов (бензилпенициллин в др.), содержат сравнительно грубодисперсный мицелий, образованный длинными переплетенными нитями толщиной около 1 мкм, имеется небольшая по весу фракция тонкодисперсных частиц. Как правило, такая культуральная жидкость легко фильтруется без предварительной обработки.
Культуралъные жидкости, получаемые при культивировании актиномицетов (стрептомицин, тетрациклин и др.), как правило, содержат липкий слизистый мицелий, состоящий из сильноразветвленных клеток с многократно переплетающимися тонкими нитями, толщиной менее 1мкм и их обрывков. В жидкости наряду с мицелиальными скоплениями присутствуют фракции тонкодисперсных белковых частиц, затрудняющих фильтрацию. Эти культуралъные жидкости в большинстве случаев необходимо подвергать обработке для коагуляции белковых коллоидов.
|
|
|
Культуральные жидкости, получаемые при культивировании бактерий (полимиксин, витамин В12 и др.) содержат довольно тонкую взвесь микробных тел, более однородную по степени дисперсности, чем в случае актиномицетных жидкостей.
Отделение мицелиальной массы от нативного раствора связано в большинстве случаев со значительными трудностями, так как большинство антибиотиков, выпускаемых промышленностью, синтезируется актиномицетами, придающими культуральной жидкости наихудшие фильтрационные характеристики. Это объясняется спецификой осадка, который, имея аморфный, слизистый, бесструктурный характер, быстро забивает поры фильтрующего материала. Кроме того, нестандартность культуральной жидкости приводит к различной фильтруемой партий культуральной жидкости одного и того же антибиотика.
|
|
|
Большое влияние на фильтрационные характеристики культуральной жидкости оказывают условия проведения ферментации (состав и качество сырья, наличие в жидкости жиров и т.д.) и правильный выбор момента прекращения биосинтеза. Ферментация должна завершаться после накопления достаточного количества антибиотика в культуральной жидкости, однако до наступления автолиза, так как фильтрация автолизованной культуральной жидкости, содержащей продукты распада клеток продуцента, протекает плохо.
Для улучшения фильтрации культуральную жидкость многих антибиотиков перед отделением мицелия подвергают специальной обработке.
Методы предварительной обработки культуральной жидкости.
Тепловая (термическая) коагуляция
Один из самых простых, но наиболее жесткий метод. Используется для антибиотиков, которые не разрушаются при нагревании в водной среде (пенициллин, эритромицин).
Культуральная жидкость нагревается до t = 70-90°С, выдерживается некоторое время и быстро охлаждается.
Недостатки метода:
а) Антитбиотики в большинстве своем термолабильны, поэтому происходит инактивация и снижение выхода целевого продукта.
б) Приводит к усилению пигментации нативного раствора, что может отразиться на качестве готового продукта.
|
|
|
в) Возможно выделение дополнительных примесей из мицелия, что также ухудшает качество готового продукта.
Кислотная коагуляция
Кислотная коагуляция широко применяется в производстве антибиотиков, которые сравнительно устойчивы при низком значении рН раствора (рН - 1,1 -1,3) (стрептомицин, тетрациклин и др.).
Выбор кислоты для снижения рН диктуется требованиями последующей химической очистки.Недостатки метода:а) При низких значениях рН происходит инактивация целевого продукта, что приводит к снижению выхода.
б) Возможность выделения в нативном растворе дополнительных примесей, затрудняющих процессы выделения и очистки, снижающих качество готового продукта.Обработка неорганическими электролитами.
Неорганические электролиты - неорганические соли, диссоциирующие в воде на ионы. Обработка электролитами имеет сравнительно ограниченное применение, так как не приводит, как правило, к удовлетворительной коагуляции белковых коллоидных взвесей без дополнительных мероприятий.
Этот метод используются на практике в основном для выделения ферментов и носит название высаливание.
|
|
|
Характерной особенностью культуральной жидкости является сравнительно низкое содержание целевых продуктов. Например, содержание биомассы при производстве дрожжей составляет 5-10%, а при производстве бактериальных препаратов не превышает 1-2%.
Большинство целевых продуктов микробиологического синтеза являются нестабильными и подвержены влиянию различных факторов. Белки, например, исключительно чувствительны к нагреванию, изменению рН среды, ко многим физическим и химическим воздействиям.
Иммобилизация ферментов путём включения в структуру геля. Органические и неорганические гели. Методы включения в альгинатный и полиакриламидный гель.
Предварительная обработка культуральной жидкости направлена не только на то, чтобы провести коагуляцию белково-коллоидных примесей, но и улучшить структуру получаемого осадка. С этой целью обработку электролитами проводят таким образом, что смешивают два электролита, которые при своем взаимодействии непосредственно в культуральной жидкости образуют осадок, повышающий плотность твердой фазы, предотвращающий слипание частиц мицелия и способствующий образованию гранул. Мицелий приобретает комковатую структуру, и вместе с белково-коллоидными примесями образует при фильтрации сравнительно хорошо проницаемый слой.
Эффективность данного метода очень высока и он широко применяется в производстве.
Обработка культуральной жидкости полиэлектролитом
Полиэлектролиты (ПЭ) - высокомолекулярные органические соединения с большим содержанием ионогенных групп в структуре.
Первыми ПЭ были ВА-2 (поли-(4-винил-Н-бензил-тиметиламмоний хлорид), ПКБ-1; ПКБ-402 - линейные полиэлектролиты.
Возможности флокуляции культуральной жидкости антибиотиков значительно расширились с использованием разветвленных ПЭ. Наиболее перспективными из них являются дисперсные формы анионитов АВ-16, АВ-17, с размером частиц ОД -5 мкм.
Разветвленные ПЭ, в отличие от линейных, обладают большей поверхностью и поэтому кроме взаимодействия по функциональным группам могут на своей поверхности адсорбировать различные примеси, повышая качество нативного раствора.
Достоинства метода:
а) метод является «мягким», целевой продукт не подвергается инактивации;
б) значительно увеличивается скорость фильтрации;
в) процесс фильтрации сопровождается депигментацией нативного раствора, что ведет к повышению качества целевого продукта.
Недостатки метода: нестабильность при хранении.На практике перед фильтрацией культуральной жидкости обычно используют сочетание нескольких из рассмотренных методов предварительной обработки. При этом достигается максимальный эффект.
Конечным продуктом стадии ферментации является культуральная жидкость (КЖ). Культуральные жидкости обычно являются сложными смесями большого числа компонентов, многие из которых обладают близкими физико-химическими свойствами. Наряду с растворенными минеральными солями, углеводами, белками и другими органическими веществами культуральные жидкости содержат в значительном количестве полидисперсные коллоидные частицы и взвеси. Следовательно, они являются не только многокомпонентными растворами, но и суспензиями. Дисперсная фаза этих суспензий состоит из мицелия или клеток микроорганизмов, а также из твердых частиц, содержащихся в большинстве питательных сред - муки, хлопьев из кукурузного экстракта и т.п.
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 1300; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!