Реакция гемагглютинации (РГА)
Применяется для идентификация вирусов по гемагглютинирующей активности. Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами (имеющие гемагглютинин – гликопротеид суперкапсида), способны гемагглютинировать эритроцитов различных животных. Например, вирусы гриппа – куриных эритроцитов.
Компоненты реакции:
1) исследуемый материал – аллантоисная жидкость(гемагглютинин вируса гриппа?);
2) 5% суспензия куриных эритроцитов;
3) физиологический раствор.
Существует два способа постановки реакции: капельный способ на стекле и объемный способ в пробирке.
Капельный способ на стекле:
Опыт:1 капля аллантоисной жидкости + 1 капля 5% суспензии куриных эритроцитов.
Контроль: 1 капля физ. раствора + 1 капля 5% суспензии куриных эритроцитов. Хорошо перемешать сначала контрольную каплю, затем- опытную.
Наличие гемагглютинации (выпадение хлопьев красного цвет) в опыте при ее отсутствии в контроле (гомогенное покраснение) указывает на содержание вируса гриппа в исследуемом материале. Гемагглютинация – это склеивание эритроцитов под влиянием гемагглютинина вируса. Вид вируса гриппа (А,В,С) дифференцируют по антигенной структуре с помощью РСК, ИФА, а серотип – РТГА (практические навыки 9.7). Окончательную идентификацию также можно провести по генетической структуре (ПЦР).
Методы индикации бактериофагов (качественные и количественные методы)
Наличие фага в исследуемом материале – фильтрате исходного материала (воды, суспензии фекалий и т.п.) определяют качественными и количественными методами.
|
|
|
Качественные методы.Присутствие фага в фильтрате определяют по его лизирующему действию на соответствующую бактериальную культуру.
1. Индикация фага в жидкой питательной среде. В пробирку с суточной бульонной культурой чувствительных к фагу бактерий (тест-культурой) вносят исследуемый фильтрат. Инкубируют в термостате 18-20 час при 37оС. Задержка роста бактерий, то есть прозрачный бульон, является показателем наличия соответствующего фага в фильтрате.
2. Индикация фага на твердой питательной среде по Отту.
Тест-культуру, например, дизентерийную культуру, засевают на поверхность МПА в чашке Петри и сверху дорожкой наносят исследумый фаг (фильтрат). Инкубируют в термостате 18-20 час при 37оС. При соответствии фага с данной культурой отмечается задержка роста бактерий по ходу дорожки (рис.20).
Количественные методы - титрование бактериофагов.
1.Титрование бактериофагов на плотной питательной среде по Грациа.
Для титрования необходимы следующие компоненты:
1) Пробирки с различными разведениями бактериофага с полужидким агаром (десятикратные разведения исследуемой суспензии фага - 10-2-10-7 в зависимости от предполагаемого титра);
|
|
|
2) ряд чашек Петри с МПА;
3) суточная бульонная культура чувствительная к фагу бактерий (E. сoli, S.aureus или др.тест-культуры).
Смешивают разведения фага с суточной бульонной культурой и выливают на поверхность МПА в чашку Петри, где она застывает в виде тонкой плёнки, в которой неподвижно фиксированы бактерии. Чашки инкубируют при 370 С в течение 18-24часов. При этом незаражённые бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности агара. Каждая инфицированная фагом бактерия лизируется. В результате на сплошном бактериальном газоне появляются четко очерченные зоны лизиса – негативные колонии. Число негативных колоний равно количеству жизнеспособных фаговых частиц в засеянной смеси. Титр фага определяют по последней чашке, где появляются негативные колонии, то есть титром фага называется то максимальное разведение, при котором появляются негативные колонии.
2.Титрование бактериофага в жидких средах по Аппельману.
В 9 пробирках приготавливают десятикратные разведения исследуемой суспензии фага с МПБ. В качестве контроля берут МПБ без бактериофага. Во все пробирки добавляется по 0,25 мл культуры бактерий, например, E.сoli. Засеянные пробирки помещаются в термостат на 24 часа при 370 С, после чего отмечаются результаты опыта. Титром бактериофага называется то наибольшее его разведение, при котором наблюдается полный лизис бактерий (бульон остается прозрачным).
|
|
|
Реакция фаголизиса
Реакция фаголизиса применяется для идентификации выделенной чистой культуры бактерий по фагочувствительности. Реакцию ставят в двух пробирках: №1 (опыт) и №2 (контроль). Реакция фаголизиса изучаем на примере идентификации выделенной чистой культуры S.sonnei из испражнения при подозрении на дизентерию.
| Компоненты | Опыт | Контроль |
| 1. МПБ 2.Исследуемая дизентерийная культура (S.sonnei) 3. Монофаг S. sonnei | + + + | + + - |
Посевы инкубируют в термостате 18-24 часов при 370 С.
При наблюдении за посевами впервые часы бульон в пробирках слегка мутнеет вследствие размножения бактерий. В дальнейшем в контрольной пробирке (без бактериофага) помутнение усиливается; в пробирке с бактериофагом через 6 часов происходит просветление в результате лизиса бактерий. Учет реакции проводятся по просветлению МПБ в результате лизируещего действия монофага на бактерии.
Дата добавления: 2018-02-28; просмотров: 1283; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!