ПРЯМОЙ МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ ПОДСЧЕТ
Чтобы определить общее количество микроорганизмов в различных материалах, применяют методы прямого подсчета клеток под микроскопом (в специальных счетных камерах, в фиксированных мазках, на мембранных фильтрах). Такие методы широко применяются в исследованиях микрофлоры воды и почвы.
Эффективность такого подсчета, как правило, в 10 – 10000 раз выше, чем при подсчете методом высева, так как многие микроорганизмы не растут на питательных средах и учесть их можно только под микроскопом. Метод дает возможность получить дополнительную информацию о размерах и морфологии изучаемого объекта. Кроме того, прямой подсчет микроорганизмов производится быстрее, более дешев, оборудование для его осуществления имеется в каждой лаборатории.
Подсчет клеток в окрашенных препаратах (метод Виноградского–Брида)
Преимущество метода заключается в том, что фиксированные окрашенные препараты хорошо сохраняются и подсчет можно проводить в удобное для исследователя время.
Техника: а) на хорошо обезжиренном предметном стекле маркером рисуют прямоугольник строго известной площади (2, 4 или 6 см²),
б) на стекло в прямоугольник микропипеткой (или автоматической пипеткой) наносят определенный объем суспензии клеток (0,01; 0,02 или 0,03 мл),
в) суспензию равномерно распределяют петлей по всей площади прямоугольника,
г) препарат высушивают на воздухе и фиксируют 15 мин 96 % этанолом,
|
|
|
д) проводят окрашивание фуксином Циля 1 – 2 мин,
е) краситель сливают, препарат промывают водой, последовательно погружая стекло в 5 – 6 стаканов с водой) и высушивают на воздухе.
Количество клеток микроорганизмов подсчитывают, используя иммерсионный объектив, в квадратах окулярной сетки, которую помещают в окуляр между собирательной и глазной линзами. При отсутствии сетки подсчитывают число клеток в поле зрения микроскопа.
Площадь квадрата сетки или поля зрения определяют с помощью объект микрометра. Последний помещают на столик микроскопа вместо препарата и при том же увеличении, при котором проводили подсчет, определяют длину стороны квадрата окулярной сетки или диаметр поля зрения.
Для получения достоверных результатов клетки микроорганизмов рекомендуется подсчитывать не менее чем в 50 – 100 полях зрения, а общее количество подсчитанных клеток не должно быть менее 600.
Количество клеток микроорганизмов, содержащихся в 1 мл исследуемого материала, вычисляют по формуле:
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПОВЕРХНОСТЕЙ
Существующие методы микробиологической оценки поверхностей не позволяют собирать все микроорганизмы. Тем не менее, их использование напищевых предприятиях может обеспечивать ценную информацию.Очевидно, что в пробах не могут быть представлены все микроорганизмы.
|
|
|
Например, для исследования микроорганизмов, имеющихся на поверхности мяса, обожженное предметное стеклоприжимают к мясу, чтобы получить отпечаток с поверхностных слоев. Готовые отпечатки, полученные с поверхностных слоев, фиксируют над пламенем спиртовки и окрашивают по Граму. Готовые препараты рассматриваютпод микроскопом с иммерсией, подсчитывая количество бактерий в полезрения, и записывают их форму. Исследуют не менее 10 полей зрения. Подсчитывают отдельно грамположительные и грамотрицательные клетки и определяют среднее количество клеток.
Смывы. Смывы берут стерильными увлажненными ватно-марлевыми тампонами размером 5 - 7 куб. см, удерживаемыми стерильным пинцетом, или ватными, марлевыми тампонами, закрепленными на стержне из проволоки или дерева.
Тампоны стерилизуют завернутыми в бумагу. В случае закрепления тампона на металлической или деревянной палочке, пропущенной через ватную пробку, его вставляют в пробирку с 10 куб. см смывной жидкости (водопроводная вода, физраствор, пептонная вода) или с 10 куб. см жидкой питательной среды для обнаружения БГКП (среда Кода, Кесслер, Хейфеца и др.). Тампон не должен касаться жидкости. Все вместе стерилизуют при (121 +/- 1) °С в течение 30 мин.
|
|
|
Непосредственно перед взятием смыва тампон не палочке увлажняют наклонением пробирки или опусканием тампона вниз. Тампоны без палочки, находящиеся в стерильной чашке Петри, увлажняют стерильной смывной жидкостью из расчета 10 мл на 1 тампон. Смывы крупного оборудования и инвентаря берут с поверхности 100 кв. см. При взятии смывов с ровной поверхности используют металлические рамки-трафареты, ограничивающие площадь 100 кв. см. Перед каждым употреблением трафарет обжигают.
После взятия смыва тампон без палочки погружают либо в пробирку со средой для БГКП, либо в пробирку со смывной жидкостью, используемую в дальнейшем для посевов на питательные среды.
Смывы с мелких объектов (поверхность которых менее 100 кв. см) берут со всей поверхности.
После взятия смыва пробку с тампоном на палочке вновь вставляют в пробирку так, чтобы тампон погрузился в смывную жидкость или жидкую питательную среду для БГКП. Посевы термостатируют при (37 +/- 1) °С в течение 18 - 24 ч. В случае помещения тампона в смывную жидкость она является после тщательного перемешивания исходным материалом для посева.
|
|
|
При определении ОМЧ из смывной жидкости готовят разведения 10 и 10
и по 1 куб. см из приготовленных разведений проводят посев в чашки Петри с
заливкой мясопептонным агаром или средой, приготовленной из сухого
питательного агара, и термостатируют при (30 + /- 1) °С в течение 48 ч.
Оставшееся количество смывной жидкости по 1 куб. см или тампон засевают в 10 куб. см жидкой питательной среды для БГКП и термостатируют, как указано выше.
Допускается контроль на наличие БГКП производить с помощью индикаторных бумажек.
При анализе чистоты рук работников, которые непосредственно соприкасаются с чистым оборудованием или продукцией, смоченным тампоном тщательно обтирают обе ладони и пальцы. Исследования смывов проводят не реже двух раз в месяц. Контроль за обработкой рук проводится перед работой, после туалета, при переходе с одного участка на другой.
Для сбора материала смыва с одной поверхности изготавливают стерильные трафареты с отверстиями, конкретного размера, которые обрабатывают тампоном, например, 1 дм2 или 1 см2 .
После наложения стерильного шаблона поверхность, выступаюшую в отверстии шаблона протирают тампоном.Использованный тампон опускают в его держатель (пробирку). Растворитель должен содержать нейтрализатор дезинфектанта, если необходимо.
Микроорганизмы подсчитывают методом «стандартный подсчет колоний».
Посев отпечатком.Метод прямого посева микроорганизмов отпечатком на агаре предполагает использование чашек Петри. Их заполняют 15-16 мл плотной среды, которая после затвердевания создает агаровую пластинку.Чашки опрокидывают, соприкасаясь с объектом исследования, агаровая плотная среда соприкасается с исследуемой поверхностью.После термостатирования засеянной таким образом чашки Петри в ней подсчитывают число колоний.
В опыте с исследованием поверхности металла, обсемененного спорами Bacillus subtilis, споры были обнаружены в более чем 40% методом отпечатков, а методом смыва – в 50% случаев .
Методы «агаровых колбасок».Этот метод предполагает использование модифицированного шприца для инъекций.У 100 мл шприцаотрезают вместе с канюлей дно и получают полый цилиндр, который заполняют агаром. Поршнем выдвигают столбик агара до конца цилиндра и прикасаются к исследуемой поверхности.Сверну столбик агара отрезают и помещают в чашку Петри, термостатируют и подсчитывают число колоний. Методику применяют для анализа микробиоты на поверхности мяса и растений. Так как скопления микроорганизмов образуют одну колонию, полученное количество микроорганизмов методом «агаровых колбасок» меньше, чем – методами с использованием пробоподготовки, которые позволяют дезинтегрировать скопления бактерий.
Другие поверхностные методы.Липкая пленка. Липкую пленку приклеивают к исследуемой поверхности, затем контактировавшей стороной накладывают на агаровую пластнку. Метод менее эффективен, чем смывы, но с успехом используется в оценке количества микроорганизмов на поверхности мяса.
Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 341; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!