СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВИРУСА АЧС.
Ввиду отсутствия вакцин против АЧС, наличие специфических антител к вирусу показывает наличие болезни.
Большое количество серологических методов диагностики АЧС было разработано в последние годы, включая методы позволяющие выполнять диагностику в полевых условиях. В настоящее время наиболее используемыми являются реакция непрямой флюоресценции (РИФ), непрямой вариант ИФА и иммуноблотинг (ИБ).
Серологические методы являются основой лабораторной диагностики АЧС и используются в программах контроля и ликвидации болезни, благодаря их высокой чувствительности и специфичности.
Рис.14.
- Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РИФ)
Данный метод является достаточно быстрым и обладает хорошей чувствительностью и специфичностью. Специфические к вирусу антитела находящиеся в сыворотке или экссудатах взаимодействуют с клетками инфицированными вирусом АЧС. В настоящее время практически не используется ввиду отсутствия коммерческих наборов для постановки реакции. Время постановки реакции занимает около 2 часов.
В случае положительного образца на клеточном монослое наблюдают флюоресценцию перинуклеарной области клеток, где расположен центр репликации вируса.
- ИФА
Этот метод используется для проведения широкомасштабного эпизоотического мониторинга и исследований при программах контроля болезни. Метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, простотой и быстротой выполнения и экономичностью. Хорошей воспроизводимостью результатов и легкостью интерпретации.
|
|
|
Рис.15.
Рис.16.
Недавно разработаны новые варианты ИФА, содержащие неинфекционные реагенты на основе рекомбинантных белков вируса p32, p54 и pp62. Они имеют большую чувствительность и специфичность при исследовании сывороток плохого качества.
Разработаны два варианта ИФА для обнаружения специфических к вирусу АЧС антител:
Рис.17.
-Hепрямой вариант ИФА-OIE: данный метод разработан в лаборатории CISA-INIA и является официальным методом диагностики одобренным OIE.
Настоящий метод ИФА основан на применение растворимого вирусного антигена содержащего большинство вирусных белков.
Рис.18.
- Коммерческие наборы ИФА (INGENASA):
Это конкурентный вариант ИФА для обнаружения антител к белку vp73 вируса АЧС (структурного компонента с высокой антигенной силой).
В данном ИФА наборе, на плашках иммобилизован белок vp73. После добавления исследуемой сыворотки, добавляются моноклональные анти-vp73 антитела, меченые пероксидазой. Моноклональные анти-vp73 антитела сорбируются на свободной от специфических антител поверхности плашки. Интерпретация результатов реакция прямо противоположна предыдущему варианту ИФА. Более интенсивная окраска лунки свидетельствует о меньшем количестве антител в сыворотке и наоборот.
|
|
|
- Иммуноблотинг
Рис.19.
Является иммунофрементным методом основанном на применении нитроцеллюлозных фильтров, несущих предварительно сорбированные на них вирусные белки. Специфические к вирусу антитела взаимодействуют с иммобилизованными вирусными белками и получившийся комплекс выявляется при помощи меченого пероксидазой протеина А.
Иммуноблотинг позволяет определить реактивность антител против различных белков индуцируемых вирусом АЧС в сыворотках свиней. Таким образом, наряду с высокой чувствительностью и объективностью получаемых результатов, иммуноблотинг является идеальным методом для подтверждения африканской чумы свиней.
Этот метод выскочувствительный, легко выполним и не требует использования специального оборудования, но также не существует коммерческих наборов. Время постановки реакции занимает около 3 часов.
Другим преимуществом данного метода является возможность хранения стрипов, содержащих антиген, при комнатной температуре, без потери активности в течении более чем одного года, что означает безопасную возможность транспортировки реагентов.
|
|
|
Нарушения и ошибки, связанные с процессом проведения исследований на АЧС. Фальсификация результатов анализов на АЧС у диких кабанов, когда от нескольких проб от одного кабана были получены разные результаты
Так как превалентность болезни при вспышках может быть различной и невысокой, особенно в подворьях населённых пунктов (Республика СО-Алания, Ставропольский край) у ветеринарных врачей (и особенно у населения) возникали вопросы к достоверности положительных результатов лабораторных исследований. В этих случаях решающее значение имело совпадение результатов РПИФ и ПЦР.
Расчёт диагностических показателей методов с использованием таблицы с двойным входом, рекомендованным МЭБ, будет неточными, так как на их величины будет иметь прямое влияние отбор проб (вид) и качество проб. Так, при исследовании проб, отобранных от больных вынужденно убитых или павших (свежих трупов) домашних свиней относительно реальной ситуации диагностическая чувствительность РПИФ=98%, ПЦР=94%. Эти данные были получены при расчётах исследования проб органов домашних свиней, доставленных из очагов АЧС в Северной Осетии, Ставропольского и Краснодарского краёв. (Табл. 3)
|
|
|
Таблица 2.
|
|
| Реальная ситуация | ||
| + | - | |||
| РПИФ | + | 102 | - | 102 |
| - | 2 | 9359 | 9361 | |
| ПЦР | + | 98 | - | 98 |
| - | 6 | 9359 | 9365 | |
| 104 | 9359 | 9463 | ||
ДЧ РПИФ=98%
ДЧ ПЦР=94%
ДС=(РПИФ=ДЧПЦР)=100%
Совпадение (РПИФ=ПЦР) =99,9%
ППР (РПИФ=ПЦР) = 100%
ПОР (РПИФ=ПЦР)= 99,9%
Однако, в результате проверки проб из трубчатых костей и реже проб органов, которые отбирали от отстрелянных и чаще павших аутолизированных диких свиней с подозрением на АЧС (Чеченская Республика, Республика Ингушетия и Кабардино-Балкарская Республика) диагностическая чувствительность РПИФ составила 87%, ПЦР -97,7%. Иногда пробы для исследования РПИФ были непригодны, а также результаты реакций не всегда совпадали. В таких случаях постановка биопробы на животных была крайне полезной.
Хорошая воспроизводимость методов была подтверждена их использованием в региональных лабораториях, сотрудники которых предварительно были обучены в ГНУ ВНИИВВиМ. (Африканская чума свиней в Российской Федерации: эпизоотология, диагностика, мониторинг болезни (февраль 2009 г.)\
Куриннов В.В., Колбасов Д.В., Цыбанов С.Ж., Васильев А.П., Лыска В.М., Калабеков И.М., Миколайчук С.В., Балышев В.А., Коломыцев А.А., Луницин А.В., Герасимов В.Н., Власов Н.А., Яковлев С.С. – ГНУ "ВНИИВВ и М", Россельхознадзор)
Возможно результатом таких неточностей являются случаи разных результатов лабораторной диагностики одного пат. материала, в частности в Клетнянском районе:
«Напомним, 21 февраля 2013 года уже было объявлено, что АЧС проникла на территорию Брянской — положительный результат на африканскую чуму свиней был установлен Почепской зональной ветлабораторией у павших диких кабанов в Клетнянском районе. Однако две ветлаборатории — в Брянске и Владимирской области — перепроверив результаты анализов, сделанных в Почепе, не подтвердили первоначальные выводы. Выводы почепских ветеринаров были объявлены ошибочными. (http://gorodbryansk.info/2014/02/rosselhoznadzor-17/) (Можно отметить, что выявление АЧС было выявлено у диких кабанов в этом районе, но через год – в феврале 2014г.).
Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 301; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!