Строение и свойства ферментов. Зависимость ферментативной реакции от рН, температуры.

⇐ ПредыдущаяСтр 23 из 24Следующая ⇒

Ферменты как белковые молекулы имеют 4 уровня организации: первичный, вторичный, третичный, четвертичтный. Ферменты с четвертичной структурой состоят из протомеров (субъединиц) - таких ферментов большинство.

Ферменты могут быть как простыми, так и сложными белками. Сложные ферменты состоят из белковой части - апофермента и небелковой - кофактора. Апоферменты и кофакторы порознь мало активны или вообще неактивны; объединение их вместе даёт активную молекулу фермента. Функции и свойства апофермента и кофактора следующие. Апофермент термолабилен, определяет специфичность фермента, участвует в соединении фермента с субстратом, активирует кофактор. Кофактор термостабилен, стабили зирует апофермент, участвует в катализе. Коферменты представлены веществами органической природы - нуклеотидами, витаминами и др. Их подразделяют следующим образом: Витаминные коферменты: (Тиаминовые (ТМФ, ТДФ, ТТФ), Флавиновые (ФМН, ФАД), Пантотеновые (КоА, дефосфо-КоА, 4-фосфопантотенат), Никотинамидные (НАД, НАДФ) и Невитаминные коферменты: Нуклеотидные (УДФ-глкжоза, другие нуклеотидные производные углеводов, спиртов и т. д.), Фосфаты моносахаридов (глюкозо- 1,6-дифосфат, 2,3-дифосфоглицерат), Металлопорфириновые (гемы, хлорофиллы), Пептидные (глутатион).

Исходными веществами для образования коферментов первой группы являются витамины, поэтому недостаточное поступление их с пищей сразу сказывается на синтезе этих коферментов, а как следствие нарушается и функция соответствующих сложных ферментов. Коферменты второй группы образуются из промежуточных продуктов обмена, поэтому недостатка в этих коферментах в физиологических условиях не бывает, и функция ферментов, с которыми они связаны, не нарушаются.

В структуре фермента выделяют ряд участков, несущих определённые функции:

1. Активный центр - место в пространственной структуре фермента, с которым связывается субстрат (вещество которое превращается под действием фермента); в состав активного центра фермента входят кофакторы; число активных центров в олигомерных ферментах может быть равно числу субъединиц - по одному центру на субъединицу; в активном центре различают контактный, или якорный участок, связывающий субстрат, и каталитический участок, где происходит превращение субстрата после его связывания; обычно активный центр фермента образуют 12-16 аминокислотных остатков, они могут находиться в разных местах полипептидной цепи, нередко на противоположных концах - при пространственной раскладке они сближаются и образуют активный центр; в катализе наиболее часто принимают участие функциональные группы ферментов:

• индольные триптофана;

• имидазольные гистидина;

• ОН - группы серина и треонина;

• SH - группы цистеина и дисульфидные цистина;

• тиоэфирные группы метионина;

• фенольные группы тирозина;

• гидрофобные цепи алифатических аминокислот и ароматическое кольцо фенилаланина;

• гуанидиновые группы аргинина;

• NH, - группы лизина и концевые NH₂ - группы полипептидной цепи;

Кроме активного у ферментов имеется аллостерический центр расположенный вне активного центра но функционально связанный с ним. Молекулы, взаимодействующие с этим центром, структурно не похожи на субстрат, но влияют на связывание и превращение субстрата в активном центре, изменяя его конфигурацию; такие вещества называют аллостерическими эффекторами, через аллостери- ческий центр они влияют на функцию активного центра: или вызывают положительный эффект (активаторы), или отрицательный (ингибиторы). Молекула фермента может иметь несколько аллостерических центров.

К основным свойствам ферментов относят:

• термолабильность;

• зависимость активности от pH среды;

• специфичность действия;

• влияние на активность активаторов и ингибиторов.

Влияние температуры

В соответствии с законами химической кинетики скорость химической реакции повышается в два раза при повышении температуры на 10°С. Однако вследствие белковой природы ферментов тепловая денатурация фермента при повышении температуры будет снижать эффективную концентрацию фермента. Так, до 45- 50°С преобладает эффект повышения скорости реакции, выше 45°С более существенной становится тепловая денатурация и быстрое падение скорости реакции.

Оптимальной температурой для действия большинства ферментов теплокровных является диапазон 37-40°С. При 100‘С почти все ферменты утрачивают свою активность (исключение - миоки- наза мышц, аденилаткиназа - выдерживающие режим кипячения). При низких температурах (0° и ниже ферменты, как правило, не денатурируют, хотя активность их падает почти до 0).

Термозависимость ферментов используется в практике:

• для разработки режима хранения продуктов питании; ферментативных препаратов; органов и тканей, являющихся материалом для трансплантации (сохранность их при низких температурах является результатом низкой акгивности собственных ферментов и ферментов микроорганизмов)

• при проведении длительных и травматичных операций на фоне искусственной гипотермии (замедление скорости ферментативных реакций позволяет снизить потребность в энергетических субстратах и кислороде и повышает толерантность тканей, в частности, к гипоксии и кровопотере)

• при искусственной гиперпирексии как составного компонента терапии ряда хронических инфекционных процессов

Влияние pH среды

Большинство ферментов наиболее активно в пределах узкой зоны концентрации водородных ионов, соответствующей физиологическим значениям pH среды (pH 6,0-8,0). Оптимум pH среды для конкретного фермента - это такое значение pH среды, при котором фермент проявляет максимальную активность

Большая часть ферментов клеток имеет оптимум pH, близкий к нейтральному (исключение - пепсин имеет оптимум pH 1,5- 2,0). Отклонение pH в ту или другую сторону ведёт к снижению скорости ферментативной реакции, что связано с изменением ионизации кислых или основных групп аминокислотных остатков активного центра.

2. Каталаза. Количественное определение. Принцип метода

Каталаза – фермент (КФ 1.11.1.6) катализирующий окислительно-восстановительную реакцию между двумя молекулами пероксида водорода: 2НООН ─каталаза→ 2НОН + О2.

В основе количественного определения каталазы лежит определение количества пероксида водорода, разложенного ферментом за определенный промежуток времени, по уравнению: 2KMnO4 + 5 H2O2 + 4 H2SO4 ↔ 2KHSO4 + 2 MnSO4 + 8HOH + 5O2

О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества перманганата калия, израсходованного на титрование перекиси водорода до и после действия каталазы.

Активность фермента выражают каталазным числом и показателем каталазы. Каталазным числом (КЧ) называют количество H2O2 мг, которое разлагается в 1 мкл (мл) крови. Показателем каталазы называют отношение каталазного числа к количеству млн эритроцитов в 1 мкл крови. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества KMnO4, израсходованного на титрование контрольной и опытной пробы.

Каталаза - фермент класса оксиредуктаз . Хромопротеид , состоит из четырех идентичных субъединиц с молекулярной массой 62000. Катализирует разложение H2O2 до воды и кислорода.

Токсичная перекись водорода H2O2 расщепляется на O2 и H2O ( H2O2=H2O+1/2 O2 ). Катализатором реакции служит каталаза EC 1.11.1.6. Она широко распространена в тканях (особенно много ее в печени). Каталаза - один из основных ферментов разрушения активных форм кислорода. Каталаза является основным первичным антиоксидантом системы защиты, который катализирует разложениеперекиси водорода до воды , разделяя эту функцию с GSH-PX . Оба фермента осуществляют детоксикацию активного кислородного радикала, катализируя образование Н2О2 из супероксида . Кроме различий в их субстратной специфичности, эти два фермента различаются сродством к субстрату. При низком содержании Н2О2 органические пероксиды преимущественно катализируются пероксидазой. Однако, при высоких концентрациях Н2О2 работают каталазы. Подобно СОД, СТ широко распространены в различных тканях. Уровень активности различается не только в разных тканях, но и внутри самой клетки. Печень , почки и красные кровяные клетки содержат высокий уровень СТ. В гепатоцитах ожидаемо высокий уровень активности наблюдается в пероксисомах , хотя СТ активен также в микросомах и в цитозоле. Каталаза-это тетрамерный гем-содержащий белок , который образуется в в цитозоле в виде мономеров, не содержащих гем. Мономеры переносятся в просвет пероксисом и там собираются в тетрамеры в присутствии гема. Хотя каталаза не содержит сигнальной последовательности, отрезаемой после использования, она должна иметь какой-то сигнал, направляющий ее в пероксисому. Согласно последним данным, эту роль, по крайней мере частично, играет специфическая последовательность из трех аминокислот, расположенная вблизи карбоксильного конца многих пероксисомных белков.

3. Иммуноферментный анализ, принцип, возможности использования. Другие области применения.

Одним из наиболее часто используемых методов в клинической и экспериментальной биохимии, вирусологии, микробиологии, ветеринарии, контроле технологии производства в медицинской и микробиологической промышленности, охране окружающей среды является в настоящее время иммуноферментный анализ (ИФА), в котором ферменты также выступают в качестве неотъемлемого компонента тест-системы.

Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу конъюгата (антивидового иммуноглобулина, меченого ферментом). Фермент вызывает разложение хромогенного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется либо визуально, либо фотометрически.

Существует множество вариантов постановки ИФА, из которых наибольшее практическое значение получил гетерогенный твердофазный ИФА. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции.

Самым распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция – процесс, при котором часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а так же с помощью образования водородных связей присоединяется к поверхности твердой фазы. В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических наборов используют полистироловые планшеты или полистироловые шарики.

Для ферментативной метки конъюгата могут быть применены разнообразные ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза.

Широкое использование стандартной конфигурации 96-луночного планшета позволило унифицировать оборудование, необходимое для проведения ИФА. Принципиальная схема твердофазного неконкурентного ИФА состоит из нескольких стадий.

Стадия 1. Специфические антигены пришиты к пластику лунок планшета. В лунку добавляется исследуемая сыворотка, и если в ней есть антитела (эти антитела наз-тся первыми) к данным антигенам, во время инкубации происходит взаимоузнавание, в результате которого образуется принципиально значимая связь антиген/антитело.

Стадия 2. После отмывки лунок от несвязавшихся субстанций в каждую лунку добавляются вторые антитела. Они узнают человеческие антитела определенного типа (IgA, IgG, IgM). К этим вторичным антителам химически пришит активный фермент. такое комплексное соединение называется конъюгат. Во время инкубации происходит взаимоузнавание первых и вторых антител, в результате чего в лунке образуется структура типа «сэндвич».

Стадия 3. После отмывки не связавшегося конъюгата в лунку добавляется бесцветный субстрат, на который действует фермент. в результате субстрат превращается в окрашенный продукт. Количество окрашенного продукта измеряется на фотометре при определенной длине волны.

Таким образом, количество цветного продукта прямо пропорционально количеству фермента в лунке, а значит и количеству конъюгата в «сэндвиче». Количество конъюгата прямо пропорционально тому количеству комплекса антиген-антитело, которое получается на стадии 1 ИФА. Следовательно, измерение развившейся цветной реакции на стадии 3 точно коррелирует с наличием специфических антител в анализируемой сыворотке. Время проведения анализа 1-3 часа.

В клинико-диагностических лабораториях ИФА применяется для следующих целей:

- диагностика инфекционных и паразитарных заболеваний: токсоплазмоза, герпеса, хламидиаза, трихомониаза, вирусов гепатита С и В, коревой краснухи, лямбиоза, микоплазмоза, описторхоза, сифилиса, уреаплазмоза, ВИЧ-инфекции.

- определение содержания гормонов и других биологически активных веществ: лютеинизирующий гормон, фолликолустимулирующий гормон, инсулин, пролактин, тестостерон, прогестерон, эстрадиол, кортизол, тиреотропный гормон, трийодтиронин, тироксин, определение цитокинов и др.

- диагностика ранних сроков беременности

- пренатальная диагностика пороков развития плода

- определение онкомаркеров: альфа-фетопротеина (для печени), раково-эмбриональный антиген (для кишечника), простатспецифический антиген, нейроспецифический антиген (маркер молочной железы), Са-125 (для яичников).

Тема: Ферменты

Билет №15

1. Распределение ферментов в организме. Множественные формы, изоферменты. Примеры.

Многие ферменты обнаруживаются практически во всех клетках организма. Это ферменты, которые участвуют в процессах жизнеобеспечения самой клетки, таких, как синтез нуклеиновых кислот и белков, образование мембран и других основных клеточных органелл, энергетический обмен. С другой стороны, дифференцированные клетки, выполняющие различные специализированные функции, различаются и по ферментному составу. Например, клетки печени содержат набор ферментов, необходимых для синтеза мочевины, клетки коры надпочечников — ферменты, синтезирующие стероидные гормоны, в мышечных клетках много креатинфосфокиназы.

Множественные формы ферментов можно разделить на две категории:

1)Изоферменты.

2)Собственно множественные формы (истинные).

Изоферменты — это ферменты, синтез которых кодируется разными генами, у них разная первичная структура и разные свойства, но они катализируют одну и ту же реакцию. Виды изоферментов:

Органные — ферменты гликолиза в печени и мышцах.

Клеточные — малатдегидрогеназа цитоплазматическая и митохондриальная (ферменты разные, но катализируют одну и ту же реакцию).

Гибридные — ферменты с четвертичной структурой, образуются в результате нековалентного связывания отдельных субъединиц (лактатдегидрогеназа — 4 субъединицы 2 типов).

Мутантные — образуются в результате единичной мутации гена.

Аллоферменты — кодируются разными аллелями одного и того же гена.

Собственно множественные формы (истинные) — это ферменты, синтез которых кодируется одним и тем же аллелем одного и того же гена, у них одинаковая первичная структура и свойства, но после синтеза на рибосомах они подвергаются модификации и становятся разными, хотя и катализируют одну и ту же реакцию.

Изоферменты разные на генетическом уровне и отличаются от первичной последовательности, а истинные множественные формы становятся разными на посттрансляционном уровне.

Дата добавления: 2019-07-17; просмотров: 871; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 15 16 17 18 19 20 21 222324 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!