Ферменты бактерий, их биологическая роль. Методы изучения ферментативной активности бактерий и ее использование для идентификации бактерий.
В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов, которые принадлежат к 6 классам: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы. Ферменты, образуемые бактериальной клеткой, могут как локализоваться внутри клетки — эндоферменты, так и выделяться в окружающую среду — экзоферменты. Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь источниками углерода и энергии. Большинство гидролаз являются экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепляют крупные молекулы пептидов, полисахаридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Некоторые экзоферменты являются ферментами агрессии, так как они способствуют проникновению и распространению бактерий в тканях организма хозяина и ослаблению его защитных свойств. К ферментам агрессии относятся: гиалуронидаза, нейраминидаза, коллагеназа, протеазы, фибринолизин, гемолизин, лейкоцидин.
Конститутивные ферменты – это ферменты, которые синтезируются клеткой с постоянной скоростью, независимо от наличия субстрата в среде. Индуцибельные (адаптивные) ферменты образуются только в присутствии соответствующего субстрата в среде (бета-галактозидаза синтезируется только при добавлении в питательную среду лактозы).
Некоторые ферменты локализованы в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в процессах переноса веществ в бактериальную клетку. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и в некоторых случаях для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзоферментов можно определить при помощи дифференциально-диагностических сред. Для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред.
|
|
|
Дифференциально-диагностические среды служат для изучения ферментативной активности бактерий. Они состоят из простой питательной среды с добавлением субстрата, на который должен подействовать фермент, и индикатора, меняющего свой цвет в результате ферментативного превращения субстрата. Примером таких сред являются среды Гисса, используемые для изучения способности бактерий ферментировать сахара.
Ферменты, разлагающие углеводы (сахаролитические ферменты) определяют на дифференциально-диагностических средах Гисса. В состав сред Гисса входит 1% пептонная вода, индикатор, поплавок для улавливания газа и 0,5% одного из углеводов (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, крахмал и т.д.). При ферментации углевода до кислоты меняется только цвет среды. При ферментации углевода до кислоты и газа меняется цвет среды и в поплавке накапливаются пузырьки газа. В качестве индикаторов используют индикатор Андреде (кислый фуксин в растворе едкого натра), индикатор ВР (смесь водного голубой и розоловой кислоты), бромтимоловый синий и др. Среды с реактивом Андреде при ферментации углеводов меняют окраску на красный цвет. Среды с индикатором ВР в кислой среде становятся синими, а в щелочной среде – красными.
|
|
|
Протеолитическая активность бактерий оценивается по расщеплению белка с образованием индола (расщепление триптофана), аммиака (разложение фенилаланина), сероводорода (разложение серосодержащих аминокислот – цистина, цистеина, метионина). Для выявления этих газообразных веществ делают посевы чистой культуры бактерий в мясо-пептонный бульон или пептонную воду в пробирки, под пробку которых помещают полоски бумаги, пропитанные индикаторами. При наличии продуктов расщепления меняется цвет соответствующего индикатора.
|
|
|
Индол: индикатор - щавелевая кислота; первоначально белая бумага окрашивается в розовый цвет.
Аммиак: индикатор – лакмус; первоначально розовая бумага окрашивается в синий цвет.
Сероводород; индикатор – ацетат свинца; первоначально белая бумага окрашивается в черный цвет (образование сульфата свинца).
Протеолитическую активность бактерий можно определить путем посева чистой культуры уколом в столбик 10-20% желатина по наличию и характеру разжижения среды (в виде перевернутой елочки, гвоздя, воронки, наполненной разжиженным желатином).
Протеолитическую активность бактерий можно определить путем посева чистой культуры в столбик свернутой сыворотки по ее разжижению.
Протеолитическую активность бактерий можно определить путем посева чистой культуры на молочный агар Эйкмана по образованию зон просветления (протеолиза) вокруг колоний.
Определение каталазы проводят следующим образом: на предметное стекло наносят исследуемую культуру и добавляют каплю 3% раствора перекиси водорода. Выделение пузырьков кислорода указывает на наличие у микроба каталазы.
|
|
|
Определение ДНКазы проводят на агаре, содержащем ДНК в конечной концентрации и хлорид кальция. После выращивания наносят раствор соляной кислоты. При положительной реакции вокруг колоний на мутном фоне образуется прозрачная зона деполимеризованной ДНК.
Определение гемолизина проводят на кровяном агаре:
- альфа-гемолиз – зеленовато-коричневый ореол вокруг колоний (гемоглобин разрушен до метгемоглобина);
- бета-гемолиз – прозрачная зона гемолиза вокруг колоний (гемоглобин разрушен полностью);
- гамма-гемолиз – видимая зона гемолиза отсутствует.
Определение плазмокоагулазы и фибринолизина проводят путем внесения культуры в плазму крови животных (кроликов). При наличии коагулазы через 0,5-4 часа в плазме образуется плотный сгусток. При наличии фибринолитической активности через 20 часов сгусток растворяется.
Определение лецитиназы проводят на агаре, содержащем яичный желток (среда Чистовича). При положительной реакции вокруг колоний возникает зона опалесценции с радужным венчиком.
5 Определение липазы проводят на агаре, содержащем яичный желток или
5% кукурузного масла. При положительном результате при косом освещении наблюдают перламутровый блестящий слой.
На разной ферментативной активности бактерий основаны многие дифференциально-диагностические среды, например, среды Эндо, Левина и Плоскирева, используемые при диагностике кишечных инфекций.
Среда Эндо состоит из МПА, лактозы и индикатора (фуксин с сульфитом натрия - фуксин-сернистая кислота). Среда бледно-розового цвета. Микробы, имеющие фермент лактазу, ферментируют лактозу с образованием альдегидов, и фуксин-сернистая кислота переходит в альдегид-сернистое соединение. Фуксин восстанавливается, окрашивая колонии в красный цвет с металлическим блеском. Лактозоотрицательные бактерии образуют бесцветные (серовато-белые) колонии.
Среда Левина состоит из МПА, лактозы и индикатора (метиленовый синий, эозин, и калия гидроортофосфат). Эта среда красно-фиолетового цвета. Лактозоположительные бактерии образуют колонии темно-синего цвета с зеленым блеском, лактозоотрицательные - бесцветные (серовато-белые) колонии.
Агар Плоскирева состоит из МПА, лактозы и индикатора (бриллиантовый зеленый, соли желчных кислот, йод, нейтральный красный). Среда коричневато- красного цвета. Эта среда является не только дифференциально-диагностической, но и элективной, так как она подавляет рост многих микроорганизмов и способствует лучшему росту возбудителей брюшного тифа, паратифов и дизентерии. Лактозоотрицательные бактерии образуют бесцветные (серовато-белые) колонии, а лактозоположительные – колонии красного (брусничного) цвета.
Дата добавления: 2019-07-15; просмотров: 978; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!