Опыт по выявлению бактерий–мутантов и доказательство спонтанности мутаций тестом перераспределения.
ЗАНЯТИЕ 9
Тема:
ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ.
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ
БАКТЕРИОФАГИ.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ.
Цель занятия: Изучить фенотипическую и генотипическую изменчивость микроорганизмов, познакомиться с классификацией мутаций бактерий, оценить последствия изменчивости для бактериальных клеток. Изучить явления трансформации, коньюгации и трансдукции в бактериальных клетках; оценить роль умеренного бактериофага в переносе генетической информации, определить роль внехромосомных генетических элементов для бактерий, познакомиться с молекулярно-генетическими исследованиями
Освоить качественные и количественные методы определения фагов.
План занятия (вопросы для обсуждения) :
1. Организация генетического материала бактерий. Репликация ДНК. Генотип и фенотип.
2. Изменчивость микроорганизмов и ее виды.
3. Модификации у бактерий.
4. Мутации у бактерий. Отличие мутаций от других видов изменчивости микроорганизмов. Классификация мутаций по происхождению, молекулярным механизмам и последствиям для бактериальной клетки.
5. Практическое использование учения о мутациях.
6. Рекомбинация – обмен генетической информацией.
7. Трансформация, ее механизм, основные этапы.
8. Коньюгация. Роль полового фактора. F+, F־, Hfr-клетки.
|
|
|
9. Трансдукция, ее механизм. Роль умеренного бактериофага.
10. Внехромосомные генетические структуры: строение, классификация, функции (плазмиды, транспозаны, Is-последовательности).
11. Молекулярно-биологические методы исследований в клинической практике (ПЦР, иммуноблотинг и др.)
12. Основы медицинской биотехнологии.
13. Генетическая инженерия. Препараты медицинского и ветеринарного назначения, полученные методом генной инженерии.
14. Умеренный бактериофаг. Явление лизогении и фаговой конверсии.
15. Применение бактериофага в практической медицине.
16. Качественные и количественные методы определения фагов. Методы выделения фага из объектов окружающей среды.
17. Фаготипирование бактерий.
Оформление протокола лабораторного занятия (выполнить дома)
1. Вклеить или нарисовать рис 5.4 из учебника А.А. Воробьева отражающий процессы трансформации, трансдукции и конъюгации (на схемах имеются 2 ошибки, определить их!!!) стр. 111
2. Записать после схемы понятия:
- конъюгация;
- трансдукция;
- трансформация;
3. Кратко законспектировать методику ПЦР. Применение (См Атлас Воробьёва и доп. материал).
4. Кратко записать принципы методов фаготипирования, титрования фага по Аппельману, Грациа, метод Отто. Для записи учета результата титрования фага по Аппельману нарисовать таблицу 9.2
|
|
|
Задания для выполнения лабораторной работы.
1. Изучить демонстрационные посевы, зафиксировать их. По качественным методам изучения бактериофагов сделать вывод. По количественному методу Аппельмана учесть результат и дать заключение.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ
ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
Опыт по изучению феномена роения Proteus mirabilis на питательном агаре и на агаре с 1% сухой желчью в чашках Петри.
Выявление фенотипической изменчивости можно провести в опыте с феноменом роения у Proteus mirabilis. Сначала изучают колонии бактерий рода Proteus, выросшие на питательном агаре в чашке Петри через 24 ч после посева разведенной культуры. Отмечают, что все колонии протея окружены «зоной роения» (рис 9.1). Пересевают колонии петлей на поверхность агара с 1% желчью в чашках Петри и инкубируют при 370С 18-24 ч. Все колонии протея, выросшие на питательном агаре с желчью, не имеют «зон роения». Вновь пересевают колонию в чашку Петри с питательным агаром и инкубируют при 370С 18-24 ч. Наблюдают, что все колонии, выросшие на питательном агаре, окружены «зоной роения».
|
|
|
Изменение фенотипа протея на питательной среде с желчью (утрату роения) следует считать модификацией, т.к. налицо все три ее отличительных признака: определенность (связь отсутствия роения с определенным фактором – желчью), общность изменений (утрата роения наблюдается у всех колоний популяции), обратимость (при отсутствии желчи в питательной среде восстанавливается исходный фенотип).
Рис.9.1. Феномен роения Proteus mirabilis на чашке Петри с МПА
Рис. 9.2. Феномен роения отсутствует на чашке Петри с МПА и 1% желчью
Опыт по выявлению бактерий–мутантов и доказательство спонтанности мутаций тестом перераспределения.
В две чашки Петри с питательным агаром вносят по 0,1 мл суточной бульонной культуры E . Coli М-17 (посевная доза 1×108 бактерий) и равномерно распределяют шпателем по поверхности питательной среды. Через 6 часов инкубации при 370С в одной из чашек перераспределяют шпателем популяцию бактерий (микроколонии) по поверхности питательной среды, а другую чашку оставляют нетронутой. Выросшие колонии через 24 ч пересевают из каждой чашки методом отпечатков с помощью штампа – репликатора на поверхность питательного агара с рифампицином (100 мкг/мл) в отдельные чашки Петри и инкубируют при 370С. Через 24 ч учитывают результат: на поверхности среды с рифампицином в чашке без перераспределения выросли единичные колонии рифампицинрезистентных мутантов; в чашке с перераспределением посевов выросли более многочисленные (в десятки-сотни раз) колонии антибиотикоустойчивых мутантов.
|
|
|
Перераспределение бактерий шпателем по поверхности питательной среды без антибиотика не оказывает влияния на число бактерий. Если допустить, что антибиотикоустойчивые мутанты возникают в результате индукции антибиотиком, то после перераспределения и без него на питательной среде с антибиотиком должно вырасти одинаковое число колоний антибиотикоустойчивых мутантов. Если же антибиотикоустойчивые мутанты возникают спонтанно и в отсутствии антибиотика, то результат будет иной. Уже в первой инкубации (через 6 часов) на среде без антибиотика на чашках появляются микроколонии антибиотикоустойчивых клеток-мутантов. Благодаря перераспределению бактерии-мутанты из этих микроколоний распространяются по всей поверхности среды и после посева отпечатками на среду с антибиотиками дадут начало многочисленным колониям мутантов, в то время как отпечатки с чашки без перераспределения выявляют только небольшое число колоний, соответственно исходным микроколониям мутантов. Полученный в данном опыте результат доказывает, что антибиотикоустойчивые мутанты возникли спонтанно до контакта бактерий с селективным агентом рифампицином.
Дата добавления: 2019-01-14; просмотров: 398; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!